【摘要】：鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),是一種感染鯽(Carassius auratus)、金魚(Carassius auratus)、及鯉與金魚雜交體的高致病性病毒,CyHV-2首次發(fā)病是在日本養(yǎng)殖的金魚中;2011、2012年,Wang等首次報道了CyHV-2可感染養(yǎng)殖鯽,造成了我國異育銀鯽(Carassius auratusgibelio)的大規(guī)模死亡。2013年,武漢、廣州、江蘇等地也報道了該病的暴發(fā),自發(fā)病異育銀鯽中檢測到CyHV-2。目前控制該病仍缺乏有效的藥物和方法,因此,迫切需要研制并建立ELISA等免疫學(xué)快速檢測方法,為該病的臨床診斷及檢測提供有效工具。本研究通過克隆CyHV-2具有良好抗原特性的膜蛋白ORF25基因部分片段,并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到原核表達(dá)載體pGEX-KG上,成功構(gòu)建了CyHV-2-ORF25-KG重組質(zhì)粒。IPTG將其誘導(dǎo)后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表達(dá),分子量大小為42 KDa,且主要表達(dá)在包涵體中。用純化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通過細(xì)胞融合,篩選出一株單抗5C6;經(jīng)間接免疫熒光試驗和Western Blot試驗驗證,這株單抗可以特異性的識別CyHV-2 ORF25蛋白。本實驗通過制備CyHV-2ORF25蛋白的單克隆抗體,為研究CyHV-2的致病機(jī)理及檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。為了克隆和表達(dá)鯉TRIM25,本研究提取鯉卵巢組織總RNA,以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版,通過PCR方法擴(kuò)增了TIRM25編碼區(qū)全長,序列分析發(fā)現(xiàn),鯉TRIM25與斑馬魚及朝鮮溠湉的氨基酸同源性較高,遺傳進(jìn)化分析也聚為一支;進(jìn)一步將其克隆至真核表達(dá)載體pCDNA4.0中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCDNA4-TRIM25,將該重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞與FHM細(xì)胞,經(jīng)間接免疫熒光、Western Blot檢測,證明TRIM25蛋白在HEK293T細(xì)胞和FHM細(xì)胞中獲得表達(dá)。該研究為鯉TRIM25的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S941.4

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本文編號：2692367