【摘要】：草魚(yú)呼腸孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是引發(fā)草魚(yú)出血病的主要病原,嚴(yán)重影響我國(guó)草魚(yú)養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展。GCRV屬于呼腸孤病毒科水生呼腸孤病毒屬的雙鏈RNA病毒,基因組分11個(gè)階段,共編碼12個(gè)蛋白。GCRV能引起宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白合成的變化,還會(huì)引起細(xì)胞融合、細(xì)胞凋亡等癥狀。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡形式,許多病毒能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡與病毒之間具有雙向作用,宿主細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞凋亡抑制病毒的感染,而病毒能夠通過(guò)細(xì)胞凋亡釋放病毒粒子。本文通過(guò)各種細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)對(duì)GCRV感染過(guò)程中CIK細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了研究,通過(guò)2-D電泳、RACE、RT-PCR等技術(shù)對(duì)草魚(yú)Trap1基因進(jìn)行了鑒定分析,并對(duì)其在GCRV誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了初步探討。主要包括以下三個(gè)方面:(1)GCRV誘導(dǎo)CIK細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。本研究主要通過(guò)不同方法檢測(cè)GCRV感染CIK細(xì)胞過(guò)程中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。用MOI=10的GCRV病毒感染CIK細(xì)胞12h后,通過(guò)DAPI染色,檢測(cè)到了明顯的凋亡小體。用MOI=1的GCRV病毒感染CIK細(xì)胞0、3、6、12、24、36、48和60 h后,分別提取不同時(shí)間點(diǎn)的基因組DNA,然后通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,在感染24 h后能看到明顯的DNA梯形條帶。TUNEL檢測(cè)試驗(yàn)也表明,用MOI=5的GCRV感染CIK細(xì)胞12 h和24 h后都能檢測(cè)到明顯的凋亡信號(hào)。同時(shí),RT-PCR結(jié)果也表明,用MO1=1的GCRV感染CIK細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后,細(xì)胞內(nèi)的Bax/Bcl-2和Caspase-3表達(dá)量分別在8 h和12 h開(kāi)始上調(diào)。此外,用MOI=1的GCRV病毒感染CIK細(xì)胞12、24、36和48 h后,膜聯(lián)蛋白標(biāo)記之后通過(guò)細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的定量檢測(cè),結(jié)果顯示,在病毒感染過(guò)程中細(xì)胞凋亡率逐漸上升并明顯高于對(duì)照組。(2)草魚(yú)Trap1基因的蛋白組學(xué)鑒定、克隆表達(dá)及分析。本研究通過(guò)對(duì)GCRV感染24 h后與未感染的CIK細(xì)胞全蛋白進(jìn)行雙向電泳和質(zhì)譜鑒定對(duì)比分析,結(jié)果顯示,蛋白點(diǎn)1061為草魚(yú)Trap1蛋白,且病毒感染24 h后的草魚(yú)Trap1蛋白表達(dá)水平是未感染的3倍以上。進(jìn)一步通過(guò)RACE擴(kuò)增技術(shù),得到了2762 bp的草魚(yú)Trap1基因全長(zhǎng),包含2157 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼718個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示草魚(yú)Trap1與斑馬魚(yú)Trap1同源性達(dá)到87%。將Trap1基因插入到p EGFP-N1載體質(zhì)粒后進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示草魚(yú)Trap1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),蛋白表達(dá)通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在Poly(I:C)刺激和GCRV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,CIK細(xì)胞中的Trap1基因轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)上調(diào)。(3)草魚(yú)Trap1基因調(diào)控病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究為了探討草魚(yú)Trap1基因在GCRV誘導(dǎo)CIK細(xì)胞凋亡中的作用,先從草魚(yú)CIK細(xì)胞c DNA中擴(kuò)增出了與Trap1相互作用并參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的兩個(gè)因子PINK1和Sorcin的基因片段,并且在GCRV感染CIK細(xì)胞過(guò)程中,PINK1和Sorcin的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)均上調(diào)。針對(duì)Trap1基因,設(shè)計(jì)三條特異性的si RNA,并通過(guò)q RT-PCR篩選出沉默效果較好的Ci Trap1-si RNA2進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。GCRV感染si RNA處理后的CIK細(xì)胞,36 h后定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示,si RNA處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于未處理或陰性si RNA處理組。本研究通過(guò)不同方法檢測(cè)GCRV感染CIK細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象,結(jié)果表明GCRV能夠誘導(dǎo)CIK細(xì)胞凋亡,然后通過(guò)雙向電泳與質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定出了具有抗凋亡作用的蛋白Trap1,而后成功克隆得到了草魚(yú)Trap1全長(zhǎng)基因,并用si RNA基因沉默方法初步證明了Trap1在GCRV感染CIK過(guò)程中起到抗細(xì)胞凋亡的作用。
【圖文】：

圖 1-1 病毒感染后 CIK 細(xì)胞核形態(tài)變化1-1 Nuclear morphological changes of CIK cells after virus in病毒感染 6 h 后的 CIK 細(xì)胞；B：病毒感染 12 h 后的 CIKA 梯形片段

圖 1-1 病毒感染后 CIK 細(xì)胞核形態(tài)變化uclear morphological changes of CIK cells after vi感染 6 h 后的 CIK 細(xì)胞；B：病毒感染 12 h 后的形片段CRV 病毒量分別感染 CIK 細(xì)胞 0 h、3 h、6得細(xì)胞總基因組總 DNA 后，用 1%瓊脂糖對(duì)照組以及 12 h 之前均未出現(xiàn)明顯的梯A 梯形條帶變化，但直至 60 h，梯形條帶IK 細(xì)胞的過(guò)程中，基因組 DNA 出現(xiàn)梯形
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S943

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2689279