【摘要】：草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是引發(fā)草魚出血病的主要病原,嚴(yán)重影響我國草魚養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展。GCRV屬于呼腸孤病毒科水生呼腸孤病毒屬的雙鏈RNA病毒,基因組分11個階段,共編碼12個蛋白。GCRV能引起宿主細胞基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白合成的變化,還會引起細胞融合、細胞凋亡等癥狀。細胞凋亡是受基因調(diào)控的一種細胞程序性死亡形式,許多病毒能夠誘導(dǎo)細胞凋亡,細胞凋亡與病毒之間具有雙向作用,宿主細胞能夠通過細胞凋亡抑制病毒的感染,而病毒能夠通過細胞凋亡釋放病毒粒子。本文通過各種細胞凋亡檢測技術(shù)對GCRV感染過程中CIK細胞的凋亡現(xiàn)象進行了研究,通過2-D電泳、RACE、RT-PCR等技術(shù)對草魚Trap1基因進行了鑒定分析,并對其在GCRV誘導(dǎo)的CIK細胞凋亡中的作用進行了初步探討。主要包括以下三個方面:(1)GCRV誘導(dǎo)CIK細胞凋亡的檢測。本研究主要通過不同方法檢測GCRV感染CIK細胞過程中的細胞凋亡現(xiàn)象。用MOI=10的GCRV病毒感染CIK細胞12h后,通過DAPI染色,檢測到了明顯的凋亡小體。用MOI=1的GCRV病毒感染CIK細胞0、3、6、12、24、36、48和60 h后,分別提取不同時間點的基因組DNA,然后通過凝膠電泳進行分析,結(jié)果顯示,在感染24 h后能看到明顯的DNA梯形條帶。TUNEL檢測試驗也表明,用MOI=5的GCRV感染CIK細胞12 h和24 h后都能檢測到明顯的凋亡信號。同時,RT-PCR結(jié)果也表明,用MO1=1的GCRV感染CIK細胞不同時間點后,細胞內(nèi)的Bax/Bcl-2和Caspase-3表達量分別在8 h和12 h開始上調(diào)。此外,用MOI=1的GCRV病毒感染CIK細胞12、24、36和48 h后,膜聯(lián)蛋白標(biāo)記之后通過細胞分析儀進行細胞凋亡的定量檢測,結(jié)果顯示,在病毒感染過程中細胞凋亡率逐漸上升并明顯高于對照組。(2)草魚Trap1基因的蛋白組學(xué)鑒定、克隆表達及分析。本研究通過對GCRV感染24 h后與未感染的CIK細胞全蛋白進行雙向電泳和質(zhì)譜鑒定對比分析,結(jié)果顯示,蛋白點1061為草魚Trap1蛋白,且病毒感染24 h后的草魚Trap1蛋白表達水平是未感染的3倍以上。進一步通過RACE擴增技術(shù),得到了2762 bp的草魚Trap1基因全長,包含2157 bp的開放閱讀框,編碼718個氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示草魚Trap1與斑馬魚Trap1同源性達到87%。將Trap1基因插入到p EGFP-N1載體質(zhì)粒后進行亞細胞定位實驗,結(jié)果顯示草魚Trap1蛋白主要在細胞質(zhì)中表達,蛋白表達通過Western Blot實驗進行驗證。在Poly(I:C)刺激和GCRV感染不同時間點后,CIK細胞中的Trap1基因轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)上調(diào)。(3)草魚Trap1基因調(diào)控病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡。本研究為了探討草魚Trap1基因在GCRV誘導(dǎo)CIK細胞凋亡中的作用,先從草魚CIK細胞c DNA中擴增出了與Trap1相互作用并參與細胞凋亡調(diào)控的兩個因子PINK1和Sorcin的基因片段,并且在GCRV感染CIK細胞過程中,PINK1和Sorcin的轉(zhuǎn)錄水平表達均上調(diào)。針對Trap1基因,設(shè)計三條特異性的si RNA,并通過q RT-PCR篩選出沉默效果較好的Ci Trap1-si RNA2進行下游實驗。GCRV感染si RNA處理后的CIK細胞,36 h后定量檢測細胞凋亡率,結(jié)果顯示,si RNA處理組細胞凋亡率明顯高于未處理或陰性si RNA處理組。本研究通過不同方法檢測GCRV感染CIK細胞的凋亡現(xiàn)象,結(jié)果表明GCRV能夠誘導(dǎo)CIK細胞凋亡,然后通過雙向電泳與質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定出了具有抗凋亡作用的蛋白Trap1,而后成功克隆得到了草魚Trap1全長基因,并用si RNA基因沉默方法初步證明了Trap1在GCRV感染CIK過程中起到抗細胞凋亡的作用。
【圖文】：

圖 1-1 病毒感染后 CIK 細胞核形態(tài)變化1-1 Nuclear morphological changes of CIK cells after virus in病毒感染 6 h 后的 CIK 細胞；B：病毒感染 12 h 后的 CIKA 梯形片段

圖 1-1 病毒感染后 CIK 細胞核形態(tài)變化uclear morphological changes of CIK cells after vi感染 6 h 后的 CIK 細胞；B：病毒感染 12 h 后的形片段CRV 病毒量分別感染 CIK 細胞 0 h、3 h、6得細胞總基因組總 DNA 后，用 1%瓊脂糖對照組以及 12 h 之前均未出現(xiàn)明顯的梯A 梯形條帶變化，但直至 60 h，梯形條帶IK 細胞的過程中，基因組 DNA 出現(xiàn)梯形
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S943

【共引文獻】

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本文編號：2689279