【摘要】：黃河鯉(Cyprinus carpio haematopteus)作為我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類的重要品種之一。近年來,在其養(yǎng)殖過程中,維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)已成為主要致病菌之一,極大的威脅了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展,針對(duì)該菌感染,目前培養(yǎng)具有抗病能力的品種是有效的防治措施之一。主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)是在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的與機(jī)體免疫相關(guān)的高度多態(tài)的基因群,在魚類中由于其高度的多態(tài)性,使其在結(jié)構(gòu)、功能、多態(tài)、表達(dá)及抗病性等方面?zhèn)涫荜P(guān)注。本研究以黃河鯉為研究對(duì)象,人工腹腔注射維氏氣單胞菌后,研究其MHCⅡ類DAA及DAB等位基因的分布,討論其與魚體抗病力的相關(guān)性,同時(shí)又采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,檢測(cè)MHCⅡ類DAA及DAB基因在正常組織中的表達(dá)情況及在感染不同時(shí)段表達(dá)量的變化趨勢(shì),為黃河鯉的分子育種與選育提供理論基礎(chǔ)和重要依據(jù),結(jié)果如下:1基于維氏氣單胞菌感染的黃河鯉MHCⅡDAA基因的多態(tài)性與抗病力的關(guān)系本研究從33尾黃河鯉(17尾抗病個(gè)體和16尾易感個(gè)體)c DNA中擴(kuò)增了長(zhǎng)度為437bp的MHCⅡDAA基因片段,該基因片段編碼部分信號(hào)肽、完整的a1、a2及部分a3結(jié)構(gòu)域。共測(cè)序165個(gè)有效克隆,核苷酸和氨基酸的變異率分別為40.95%(172/420)、65%(91/140)。共獲得54個(gè)不同的等位基因,各等位基因的頻數(shù)及其各主型中亞型的數(shù)目都不均衡,其中等位基因Cyca-DAA*0101、Cyca-DAA*1502出現(xiàn)的頻數(shù)最大,分別為0.1212和0.0909。有4個(gè)等位基因在抗病群體及易感群體中均有出現(xiàn),等位基因Cyca-DAA*0101在抗病群體出現(xiàn)的頻率為9.09%,而在易感群體出現(xiàn)的頻率僅為3.03%,差異極顯著(P0.01)。29個(gè)等位基因?yàn)榭共∪后w特有,Cyca-DAA*0901(5.45%)(P0.01)所占比例最大,有19個(gè)等位基因與黃河鯉對(duì)維氏氣單胞菌的易感性相關(guān),其中Cyca-DAA*1502(9.09%)(P0.01)所占比例最大。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)抗原結(jié)合位點(diǎn)(PBR)和非抗原結(jié)合位點(diǎn)(non-PBR)的比值(d N/d S)分別為2.556和0.769,說明正向選擇機(jī)制在黃河鯉MHCⅡDAA基因的自然進(jìn)化過程中占主導(dǎo)地位。熒光定量PCR結(jié)果表明MHCⅡDAA基因在健康黃河鯉的9個(gè)組織中均有表達(dá),其中較強(qiáng)表達(dá)于腎、肝、腸、脾,在心臟、鰓、腦表達(dá)量有所降低,而表達(dá)量最低的組織為肌肉和眼。人工感染維氏氣單胞菌后,DAA基因在感染不同時(shí)段肝、脾、腎、腸組織中表達(dá)量有所變化,表明MHCⅡDAA基因在黃河鯉抵抗病原的侵入過程中起著重要作用。2基于維氏氣單胞菌感染的黃河鯉MHCⅡDAB基因的多態(tài)性與抗病力的關(guān)系本研究在17尾抗病個(gè)體和16尾易感個(gè)體黃河鯉c DNA中擴(kuò)增了包括部分信號(hào)肽結(jié)構(gòu)、完整的β1結(jié)構(gòu)及部分β2結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為327bp基因片段。測(cè)序165個(gè)有效克隆共獲得72個(gè)等位基因,核苷酸和氨基酸的變異位分別為221、104,變異率為67.58%和100%。每個(gè)個(gè)體為多基因座及每個(gè)基因座都含有數(shù)量眾多的等位基因,出現(xiàn)頻率較高的等位基因?yàn)镃yca-DAB*0801(0.151)、Cyca-DAB*1001(0.0909)、Cyca-DAB*0701(0.0788)。5個(gè)等位基因在抗病群體及易感群體中均有出現(xiàn),其中Cyca-DAB*0202、Cyca-DAB*1001在易感群體中出現(xiàn)的頻率顯著(P0.05)高于抗病群體中出現(xiàn)的頻率,而在抗病群體中,Cyca-DAB*0101出現(xiàn)的頻率明顯大于在易感群體出現(xiàn)的頻率,差異極顯著(P0.01)。有38個(gè)等位基因與黃河鯉對(duì)維氏氣單胞菌的抗性相關(guān),各等位基因分布的頻率差異不顯著,29個(gè)等位基因與黃河鯉對(duì)維氏氣單胞菌的易感性相關(guān),其中等位基因Cyca-DAB*1001出現(xiàn)的頻率最高(9.09%),差異極顯著(P0.01)。非同義替代與同義替代的比率(d N/d S)在PBR和非PBR結(jié)合區(qū)分別為2.556和0.898,證明平衡選擇是黃河鯉存在眾多DAB等位基因的發(fā)生機(jī)制。熒光定量PCR結(jié)果顯示在健康黃河鯉肝、腎、脾、鰓等9個(gè)組織中均能擴(kuò)增出MHCⅡDAB基因,結(jié)果顯示DAB基因在腎、肝、脾、鰓中高度表達(dá),中等表達(dá)于心臟、腸道,在腦、眼、肌肉表達(dá)量最低。黃河鯉在感染維氏氣單胞菌后,組織中MHCⅡDAB基因的表達(dá)水平變化較大的組織分別為肝、脾、腎、鰓,說明MHCⅡDAB基因在黃河鯉的免疫反應(yīng)中起著重要作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2688950