【摘要】：金錢魚(Scatophagus argus),隸屬于鱸形目(Perciformes),金錢魚科(Scatophagidae),金錢魚屬(Scatophagus),是一種兼具觀賞和經(jīng)濟價值的優(yōu)質(zhì)品種。金錢魚抗病性和環(huán)境適應(yīng)性極強,逐漸成為沿海地區(qū)養(yǎng)殖的重要種類,但是由于金錢魚雌雄性腺發(fā)育不同步,人工繁育技術(shù)不成熟,大部分魚苗來自野外捕撈,極大地影響了養(yǎng)殖規(guī)模,因此研究金錢魚性腺發(fā)育相關(guān)基因,不但可以初步提供硬骨魚類繁殖的分子機制材料,而且也可為指導(dǎo)金錢魚人工育苗提供幫助。目前,對金錢魚形態(tài)學(xué),組織學(xué)以及性腺分化相關(guān)基因有了初步研究,與其他脊椎動物相比,關(guān)于金錢魚生殖方面的分子生物學(xué)研究還處在初級階段。因此,獲得性腺發(fā)育相關(guān)基因,闡述其表達模式,可為金錢魚性腺發(fā)育和性別差異的分子機制提供基礎(chǔ)研究資料。本文以金錢魚精巢和卵巢的高通量測序數(shù)據(jù)庫中獲得的雌激素受體序列片段,并且參考已經(jīng)提交的硬骨魚類雌激素受體各亞型序列進行引物設(shè)計,獲得中間片段,利用RACR技術(shù),以已獲得的中間片段為基礎(chǔ)得到了金錢魚雌激素受體ERα,ERβ1和ERβ2全長c DNA序列,通過半定量和熒光定量技術(shù)分析了三種受體在金錢魚雌魚和雄魚各器官以及精巢和卵巢發(fā)育過程中的表達模式。結(jié)果如下:1)ERα基因全長共2621bp,5′-UTR(非編碼區(qū))241bp,3′-UTR472bp,編碼635個氨基酸;預(yù)測分子量為69.38 KD。組織分布結(jié)果顯示,金錢魚ERα雌性和雄性在所檢測組織器官中都有分布,但主要在肝臟,腦,垂體以及精巢表達。熒光定量檢測雌雄性腺中表達含量,ERα在卵巢發(fā)育早期以及卵黃充滿期表達量較高,隨著精巢發(fā)育ERα表達量顯著升高。2)ERβ1全長2891bp,5′-UTR 597bp,3′-UTR 611bp,編碼560個氨基酸,預(yù)測分子量為63.02KD。組織分布結(jié)果顯示,金錢魚ERβ1在所測組織中也都有表達,主要分布在雌魚和雄魚腦,垂體以及精巢等器官,但肝臟中幾乎不表達。ERβ1在早期卵巢發(fā)育中表達量較高,卵黃積累時期逐漸升高,而在精巢發(fā)育過程中先升高后降低,其中在精母細胞增長期最高。3)ERβ2全長2410bp,5′-UTR 281bp,3′-UTR 168bp,共編碼657個氨基酸,預(yù)測分子量為72.44 KD。ERβ2主要在肝臟中表達,隨著卵巢逐漸成熟,含量逐漸降低,而在精巢發(fā)育過程中一直維持高表達,但在精子變態(tài)期時顯著下降。本研究采用原位雜交實驗檢測金錢魚配子發(fā)生過程中的表達定位,結(jié)果如下:1)ERβ1在卵巢發(fā)育的各個時期均有表達,在卵原細胞,初級卵母細胞,以及成熟卵母細胞中均有表達。精巢發(fā)育中,精原細胞含量最高,而在初級精母細胞以及精細胞中信號較弱,但是在整個精子產(chǎn)生過程中間質(zhì)細胞的表達量都很高。2)ERβ2在卵子產(chǎn)生初期主要在卵原細胞,卵母細胞表達;而卵黃合成期的卵母細胞中表達較弱,在成熟卵母細胞中表達量極高。精子產(chǎn)生過程中ERβ2也主要在精巢間質(zhì)細胞和精原細胞中存再強陽性信號,精母細胞以及精細胞信號較弱。綜上所述,克隆分析金錢魚雌激素受體在各組織和性腺發(fā)育各時期表達情況,表明三種雌激素受體可能在性腺發(fā)育中起到重要的作用,但是起主要作用的時期不盡相同。原位雜交結(jié)果顯示,ERβs在早期卵母細胞發(fā)育中表達位置一致,而在卵黃蛋白合成期時ERβ2主要在卵細胞核中表達,表明兩種受體雖然都促進卵原細胞增殖,但作用機制可能不同。ERβs在精巢間質(zhì)細胞和精原細胞雜交信號較強,表明雌激素結(jié)合雌激素受體可能通過影響間質(zhì)細胞的功能調(diào)控精巢配子發(fā)生過程。本實驗探究結(jié)果為從分子水平方面了解金錢魚繁殖機制提供了基本資料。
【圖文】：

制原生殖細胞的增殖[31]；雌激素也可刺激卵黃蛋白原表達，育。雌激素在精巢發(fā)育中的作用也無可替代。雌激素可以調(diào)節(jié)促進精原細胞增殖和分化[32]。虹鱒中發(fā)現(xiàn)，低濃度雌二醇可以新，高濃度則會抑制精原干細胞增殖和精子發(fā)生[33]。雄性成可以促進精子發(fā)生，而高濃度的雌二醇可能導(dǎo)致雄性不育。素發(fā)揮以上生理作用需要特異性結(jié)合分布在細胞膜和細胞核內(nèi)strogen receptor, ER）。ER 屬于核受體，依賴配體發(fā)揮作用。通胞核內(nèi) ER 結(jié)合，，激活相關(guān) DNA 上的反應(yīng)元件，進而調(diào)控 mR生具體效應(yīng)，這類過程即核受體基因組途徑。但是近來研究發(fā)某些生理學(xué)過程中作用非�？欤謴�(fù)也快，同時可在不含核受應(yīng)，并且轉(zhuǎn)錄合成抑制劑也不能將其阻斷，證實了存在快速非而且在哺乳動物的心肌細胞[34]，骨骼肌細胞[35]，魚類精巢[36]，體介導(dǎo)的非基因組途徑（圖 1-1）。因此，對與雌激素結(jié)合后的雌激素受體的研究也成為了物種的生殖發(fā)育過程研究中重要

實驗技術(shù)路線圖
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2687052