【摘要】：長江刀鱭是長江下游流域最為重要的捕撈和消費(fèi)對象,是目前長江流域唯一能形成穩(wěn)定漁汛的江海洄游型魚類。在水域生態(tài)環(huán)境惡化及人類捕撈脅迫的雙重影響下,長江刀鱭資源日趨枯竭,目前年捕撈量僅約為歷史最高紀(jì)錄的2%。本研究系統(tǒng)調(diào)查長江刀鱭線蟲感染特征及寄生線蟲群落特征;基于簡化基因組技術(shù)和耳石指紋元素技術(shù)篩選出遺傳背景相似、洄游履歷相近的長江刀鱭實(shí)驗(yàn)樣本,綜合利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組技術(shù)研究長江刀鱭感染異尖線蟲后相關(guān)免疫基因及代謝產(chǎn)物的變化,揭示與感染異尖線蟲相關(guān)的免疫信號通路,探討洄游群體感染異尖線蟲后所產(chǎn)生的免疫適應(yīng)性反應(yīng)。結(jié)合長江刀鱭種群生態(tài)學(xué)研究,進(jìn)一步探討長江刀鱭與寄生異尖線蟲間的相互作用機(jī)制,研究結(jié)果對于后續(xù)異尖線蟲感染對長江刀鱭種群補(bǔ)充的影響研究具有積極意義。本文主要研究內(nèi)容如下:系統(tǒng)調(diào)查了長江刀鱭感染線蟲情況。漁汛期內(nèi)在長江口至鄱陽湖的7個調(diào)查斷面上共采集長江刀鱭695尾,從541尾樣本中檢出線蟲7271條,總體感染率為77.84%,平均感染強(qiáng)度為13.44±30.68條/尾,平均感染豐度為10.46±27.63條/尾,不同斷面間刀鱭樣本線蟲感染強(qiáng)度和感染豐度差異顯著(p0.05)。利用分子鑒定方法對隨機(jī)抽樣的1160條線蟲的鑒定結(jié)果顯示,共檢出異尖科線蟲2屬6種,分別為派氏異尖線蟲(Anisakis pegreffii)、簡單異尖線蟲(A.simplex)、內(nèi)彎宮脂線蟲(Hysterothylacium aduncum)、費(fèi)氏宮脂線蟲(H.fabri)、中華宮脂線蟲(H.sinens)和廈門宮脂線蟲(H.amoyense),其中派氏異尖線蟲為優(yōu)勢種,占84.84%。ITS序列分析結(jié)果顯示,派氏異尖線蟲的單倍型多樣性(Hd)為0.174,核苷酸多樣性(π)為0.00028,各斷面群體間沒有發(fā)生明顯的遺傳分化(Fst0.05),總基因流(Nm)為75.74,群體間基因交流充分。研究了長江刀鱭抽樣群體遺傳背景。利用2b-RAD技術(shù)對165尾長江刀鱭樣本進(jìn)行測序,經(jīng)篩選和聚類分析后,獲得373244個標(biāo)簽,其平均Unique標(biāo)簽數(shù)為289602個,Unique標(biāo)簽比對率變幅為73.77%-80.25%。利用SOAP軟件將過濾后的Enzyme Reads比對到參考序列,以最大似然法(ML)進(jìn)行SNP標(biāo)記分型,共獲得SNP標(biāo)記36975個,其中高度多態(tài)性的SNP(PIC0.5)位點(diǎn)共計26個。群體二態(tài)性SNP標(biāo)記36469個,其中以A/G和C/T轉(zhuǎn)換的形式為主,分別有10013個和12881個,分別占SNP總量的27.08%和34.84%;轉(zhuǎn)換與顛換比為1.69。分組間平均觀測雜合度Ho變化范圍為0.1286-0.1408,平均期望雜合度He最小為0.1340,最大為0.1446,各分組間遺傳分化系數(shù)均低于0.005。表明長江刀鱭洄游群體遺傳分化程度極低,個體信息交流緊密,雜合度較高,具有豐富的遺傳多樣性。通過本次篩選驗(yàn)證可保證長江刀鱭組學(xué)實(shí)驗(yàn)樣本具有相似的遺傳背景,進(jìn)而排除實(shí)驗(yàn)樣本種質(zhì)差異對分析結(jié)果的干擾。研究了長江刀鱭抽樣群體生境履歷。利用耳石指紋元素技術(shù)對81尾長江刀鱭樣本的生境履歷進(jìn)行反演,共發(fā)現(xiàn)3種生態(tài)類型:江-海洄游型(91.36%)、江-河口洄游型(6.17%)和淡水定居型(2.47%)。就感染線蟲與生境履歷的關(guān)系而言,所有感染線蟲的長江刀鱭樣本均具有江海洄游履歷,但具有江海洄游履歷的長江刀鱭不一定感染線蟲,淡水定居型均未感染線蟲。本次篩選驗(yàn)證可保證長江刀鱭組學(xué)樣本具有相近的洄游履歷,進(jìn)而排除實(shí)驗(yàn)樣本因棲息生境的差異對分析結(jié)果產(chǎn)生干擾。進(jìn)行了長江刀鱭肝臟轉(zhuǎn)錄組分析。利用RNA-seq技術(shù)對感染異尖線蟲后的長江刀鱭肝臟組織進(jìn)行表達(dá)譜分析。測序完成后,對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、組裝后共獲得62604條Unigene。通過GO和KEGG等生物信息學(xué)方法對Unigene進(jìn)行注釋和分析,并預(yù)測其功能。對基因表達(dá)差異分析,共獲得961個差異表達(dá)基因,包括545個上調(diào)基因和416個下調(diào)基因。10個宿主基因qRT-PCR檢測結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致,進(jìn)一步證明RNA測序結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。通過pathway富集分析,篩選出免疫相關(guān)基因和免疫信號通路,包括參與抗原加工和呈遞過程的MHCⅡ、TCR、CTSL以及CIITA基因和參與T細(xì)胞受體信號通路的TCR、CD3D、LCP2、ITK、IL10以及p38基因。本研究為進(jìn)一步了解異尖線蟲和長江刀鱭之間的相互作用機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支撐。進(jìn)行了長江刀鱭血清代謝組分析。利用GC/MS技術(shù)對感染異尖線蟲后的長江刀鱭血清進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,共檢測出65種差異代謝物,其中28種代謝物上調(diào),37種代謝物下調(diào)。多元統(tǒng)計分析(PLS-DA和OPLS-DA)表明,異尖線蟲感染對刀鱭血清代謝譜產(chǎn)生了顯著(p0.05)影響。對異尖線蟲感染后的長江刀鱭血清中代謝物及其參與的代謝通路進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)甘油酯代謝、生物素代謝、戊糖磷酸循環(huán)、丙氨酸代謝、d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代謝、嘧啶代謝和三羧酸循環(huán)通路中有很多代謝物及調(diào)控相關(guān)代謝物合成的基因都出現(xiàn)了表達(dá)量變化。此外,還發(fā)現(xiàn)DAG的表達(dá)量顯著上調(diào),并在T細(xì)胞激活所需的關(guān)鍵免疫通路中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖 2-1 長江刀鱭采樣斷面示意圖Figure 2-1 Sketch for sampling sites of C. nasus.2 主要儀器與試劑主要儀器設(shè)備：Leica M165C 解剖鏡；PCR 儀；電泳儀；BOX F3 凝膠成像

圖 2-2 不同數(shù)量線蟲感染宿主的比例Percentage of host infected the different number of nem鱭線蟲感染情況1~9 10~19 20~29 30~39 >40寄生線蟲數(shù)量
【學(xué)位授予單位】：安徽師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S943

【參考文獻(xiàn)】

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1 毛成責(zé);矯新明;鐘俊生;花衛(wèi)華;張曉昱;吳建新;;長江口刀鱭資源現(xiàn)狀及保護(hù)研究進(jìn)展[J];淮海工學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年03期

2 盧明杰;姜濤;劉洪波;陳婷婷;楊健;;信江發(fā)現(xiàn)溯河洄游型刀鱭的實(shí)證研究[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2015年05期

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4 王美W，

本文編號：2686539