【摘要】：團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一,但是近年來由于嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥較為嚴(yán)重,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。魚類獲得性免疫系統(tǒng)不夠發(fā)達(dá),先天性免疫系統(tǒng)在抵御病原體入侵中發(fā)揮著不可替代的作用。補(bǔ)體系統(tǒng)是先天性免疫的重要組成部分,補(bǔ)體替代途徑包括補(bǔ)體因子D(complement factor D)、補(bǔ)體因子P(complement factor P)、補(bǔ)體因子I(complement factor I)和補(bǔ)體因子H(complement factor H),被稱為最古老的補(bǔ)體激活途徑,對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活有著重要作用。對(duì)補(bǔ)體替代途徑相關(guān)分子的研究,有助于我們了解團(tuán)頭魴先天性免疫防御機(jī)制,對(duì)團(tuán)頭魴病害防控和遺傳育種方面具有重要意義。本研究克隆了團(tuán)頭魴Pf(MamPf)、If(MamIf)和Hf(MamHf)基因的ORF序列,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)這些基因在健康組織和感染嗜水氣單胞菌后免疫組織的表達(dá)進(jìn)行了分析。原核表達(dá)MamDf重組蛋白,檢測MamDf重組蛋白的抑菌活性。利用Western blot技術(shù)檢測了團(tuán)頭魴肝臟、脾臟、腎臟和頭腎中MamDf蛋白在感染嗜水氣單胞菌后的表達(dá)變化。本研究主要結(jié)果如下:1.團(tuán)頭魴3個(gè)補(bǔ)體基因(MamPf、MamIf和MamHf)的序列分析MamPf ORF全長1329 bp,編碼442個(gè)氨基酸,DNAstar預(yù)測其分子量為48.9kDa。NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測顯示其沒有N-糖基化位點(diǎn)。多序列比對(duì)分析顯示,團(tuán)頭魴和其他物種的Pf都是由6個(gè)TSR結(jié)構(gòu)域組成,而且TSR結(jié)構(gòu)域中有相應(yīng)的保守序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,魚類Pf聚為一支,哺乳動(dòng)物聚為另一支,團(tuán)頭魴與斑馬魚的Pf在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近�；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示,團(tuán)頭魴Pf基因含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,不同物種間外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量相似。MamIf ORF全長2007 bp,編碼668個(gè)氨基酸,其分子量為74.6kDa,具有6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。團(tuán)頭魴和其他物種的If都是由1個(gè)FIMAC結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域、2個(gè)LDLa結(jié)構(gòu)域和一個(gè)絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶超家族結(jié)構(gòu)域組成,而且不同物種中每個(gè)結(jié)構(gòu)域中都有相應(yīng)的保守序列。團(tuán)頭魴與鯉的If在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近,魚類If聚為一支,哺乳動(dòng)物單獨(dú)聚為另一支。MamHfORF全長2589 bp,編碼862個(gè)氨基酸,其分子量為97.5kDa,具有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。團(tuán)頭魴Hf基因含有13個(gè)重復(fù)的SCRs結(jié)構(gòu)域,不同物種具有的SCR結(jié)構(gòu)域的數(shù)量不同。團(tuán)頭魴與斑馬魚的Hf在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近,魚類Hf聚為一支,哺乳動(dòng)物單獨(dú)聚為另一支。2.團(tuán)頭魴3個(gè)補(bǔ)體基因(MamPf、MamIf和MamHf)在健康組織和感染嗜水氣單胞菌后免疫相關(guān)組織中的表達(dá)MamPf、MamIf和MamHf基因在健康團(tuán)頭魴10種組織中均有表達(dá)。MamPf基因在腎臟中表達(dá)量最高,在腸中表達(dá)量最低,在其他組織中均有表達(dá);MamIf基因在肝臟中表達(dá)量最高,在腎臟、血液、鰓和心臟中表達(dá)量高,在腦中表達(dá)量最低;MamHf基因在肝臟中表達(dá)量最高,在肌肉中表達(dá)量最低,在其他組織中均有表達(dá)。感染嗜水氣單胞菌后,各組織中MamPf、MamIf和MamHf基因mRNA發(fā)生了顯著性的變化,但不盡相同。在肝臟中,MamPf在感染后24 h顯著上調(diào)并達(dá)到峰值,5 d時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平;MamIf在感染后4 h有顯著性上調(diào),5 d時(shí)顯著上調(diào)并達(dá)到峰值;MamHf在4 h～5 d均顯著上調(diào),3 d時(shí)達(dá)到最大值。在脾臟中,MamPf在感染后4 h,表達(dá)量顯著下調(diào),24 h顯著上調(diào)并達(dá)到峰值;MamIf在4h顯著上調(diào)并達(dá)到峰值,而后降低到對(duì)照組水平;MamHf在4h顯著上調(diào)并達(dá)到最大值,24h降低到對(duì)照組水平。在腎臟中,MamPf表達(dá)量在感染后4h～5d均顯著上調(diào),4h達(dá)到峰值;MamIf表達(dá)量在4h顯著上調(diào)并達(dá)到峰值,24 h顯著下調(diào),3d降低到對(duì)照組水平;MamHf在4h和24h都顯著上調(diào),并且在4h達(dá)到最大值。在頭腎中,MamPf表達(dá)量在4h~3d均顯著上調(diào),并且在4h達(dá)到最大值,5d降低到對(duì)照組水平;MamIf在4h顯著上調(diào)并達(dá)到最大值后顯著下調(diào),后在5d時(shí)達(dá)到對(duì)照組水平;MamHf在4 h和24 h都顯著上調(diào),并且在4 h達(dá)到最大值,3 d后回到對(duì)照組水平。3.團(tuán)頭魴補(bǔ)體因子D(MamDf)重組蛋白抑菌活性及Western blot分析MamDf基因有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。成功構(gòu)建了pET28a-Df原核表達(dá)載體,并且篩選了最佳表達(dá)條件(37℃、180 r/min、IPTG=0.05mmol/L誘導(dǎo)6 h)。MamDf重組蛋白對(duì)嗜水氣單胞菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長有明顯的抑制效果,而且,重組蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果要強(qiáng)于格蘭氏陽性菌。采用Western blot方法分析了團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌后免疫組織的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在嗜水氣單胞菌刺激后4 h-5 d內(nèi),MamDf在肝臟、脾臟、腎臟和頭腎中都有明顯的上調(diào)。
【圖文】：

三種途徑的激活導(dǎo)致經(jīng)典/凝集素途徑 C3 轉(zhuǎn)化酶（C4b2b）和替代途徑 C3 轉(zhuǎn)化酶（C3bBb）的產(chǎn)生（Holers 2014）。C3 被切割后產(chǎn)生 C3a 和 C3b 這兩個(gè)主要的片段，C3a 是一種有效的炎癥介質(zhì)，C3b 是一種調(diào)理素，它沉積在靶細(xì)胞和顆粒的表面，促進(jìn)吞噬作用。C3b 還可以正反饋形成更多的 C3 轉(zhuǎn)化酶，擴(kuò)大補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，C3b 與已經(jīng)存在的 C3 轉(zhuǎn)化酶結(jié)合后，形成復(fù)合物 C5 轉(zhuǎn)化酶，C5 轉(zhuǎn)化酶有切割 C5 的能力，以此激活補(bǔ)體終末途徑，最后形成膜攻擊復(fù)合物來導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解和炎癥反應(yīng)（Merle et al 2015）。盡管這些活化過程對(duì)病原微生物的清除是有利的，但它們對(duì)宿主細(xì)胞具有潛在的破壞性。為了防止宿主組織的損傷，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活受膜結(jié)合蛋白和血漿調(diào)節(jié)分子的嚴(yán)格調(diào)節(jié)（Chuang et al2010）。而且替代途徑還可以作為經(jīng)典途徑和凝集素途徑的擴(kuò)大環(huán)路，據(jù)研究表明，，即使補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)由經(jīng)典途徑和凝集素途徑啟動(dòng)，替代途徑產(chǎn)生的活性物質(zhì)也可占補(bǔ)體激活產(chǎn)物的80%，因此替代途徑的調(diào)節(jié)尤其重要（Harboe et al 2008）。

VA）和 T 檢驗(yàn)，并用 Duncan 進(jìn)行多重比較，數(shù)值均采用平均值±標(biāo)an±SE）表示，當(dāng) P<0.05 時(shí)，認(rèn)為差異顯著；當(dāng) P<0.01 時(shí)，認(rèn)為差。果與分析總 RNA 提取結(jié)果結(jié)果如圖 2-1 所示，所提取的團(tuán)頭魴總 RNA 有三條帶，從大到小依次為和 5S，從圖中可以看出 28S 和 18S 的亮度比大約是 2:1 且條帶明亮，較弱，表明提取的總 RNA 具有較好的完整性。經(jīng)超微量紫外分光光度 OD260/OD280的值也都在 2.0 左右，表明總 RNA 的純度較高，可用于后
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2683449