【摘要】：隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的不斷發(fā)展,大量的含氮有機物沉積水體中,導致水體中亞硝酸鹽濃度不斷升高。高濃度亞硝酸鹽暴露會引起魚類產生氧化應激,造成未折疊、錯折疊、突變蛋白積累,破壞內質網穩(wěn)態(tài)并引起內質網應激,導致魚類的大量死亡。為了應對這種環(huán)境應激,機體內質網會做出未折疊蛋白反應的保護性或適應性策略,以恢復內質網的穩(wěn)態(tài),如果內質網應激持續(xù),細胞會開始出現(xiàn)凋亡。本研究分別從內質網應激和細胞凋亡的角度,探究了亞硝酸鈉對草魚肝臟組織、肝細胞和腎細胞的毒性損傷,以期為草魚的科學化養(yǎng)殖提供可靠的科學理論依據。亞硝酸鈉急性暴露草魚實驗中,分別用0 mg/L、8 mg/L、13 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的亞硝酸鈉的溶液暴露草魚,暴露時間為0 h,12 h,24 h,48 h和96 h,每個實驗組設3個重復。實驗結束后,采集草魚的肝臟組織,進行細胞凋亡和內質網應激IRE1通路相關基因相對表達量、生化指標和抗氧化酶活性檢測,采集草魚鰓組織和肝臟組織檢測組織學變化。亞硝酸鈉急性暴露草魚肝細胞實驗中,分別用0 mg/L、5 mg/L、20 mg/L和50 mg/L的亞硝酸鈉溶液暴露草魚肝細胞(L8824),在暴露后12 h和24 h后,檢測細胞活力、細胞凋亡和內質網應激IRE1通路相關基因相對表達量、細胞凋亡率以及細胞內游離鈣離子變化。加入內質網應激通路IRE1α核酸內切酶的抑制劑,進行細胞活力、內質網應激IRE1通路和細胞凋亡相關基因相對表達量、細胞凋亡率以及細胞質內游離鈣離子變化的檢測。亞硝酸鈉急性暴露草魚腎細胞(CIK)實驗中,分別用0 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的亞硝酸鈉溶液處理草魚腎細胞12 h和24 h后,檢測細胞活性、內質網應激和細胞凋亡相關基因相對表達量、細胞凋亡率。實驗結果如下:1.對照組草魚的鰓組織中,鰓片及鰓絲排列緊密有序,結構完整。草魚暴露在50 mg/L亞硝酸鹽96 h后,鰓小片出現(xiàn)基底上皮的增厚黏液細胞分泌增多,鰓小葉黏連,黏液細胞大量浸潤鰓小葉之間,鰓小葉增生扭曲。對照組草魚的肝臟組織中,肝細胞總體形態(tài)規(guī)律,細胞核位置明顯,但在50 mg/L的亞硝酸鹽暴露96 h后,出現(xiàn)了明顯脂肪空泡化現(xiàn)象,組織充血,肝細胞水腫,細胞質溶解。肝糖原的含量在亞硝酸鈉暴露高濃度組發(fā)生顯著性的降低,堿性磷酸酶在亞硝酸鈉暴露12 h和24 h發(fā)生了顯著性的上升,而在亞硝酸鈉暴露48 h和96 h后發(fā)生了顯著性的下降,在亞硝酸鈉暴露12 h后SOD的活性顯著升高,而在隨著暴露毒時間的延長,SOD的活性與對照相比顯著下降。grp78、ire1α和xbp1s mRNA在亞硝酸鈉暴露后表達量與對照相比明顯上升,其中grp78 mRNA表達量在亞硝酸鹽暴露96 h后達到最大值,而ire1α和xbp1s表達量在暴露12 h后達到最大值。2.亞硝酸鈉急性暴露草魚肝細胞實驗中,亞硝酸鈉處理組的細胞凋亡率顯著上升,jnk、bax、caspase9、caspase3、ire1α、xbp1s和grp78 mRNA表達量顯著升高,bcl-2 mRNA的表達量顯著下降,細胞內鈣離子濃度顯著上升。與亞硝酸鈉單處理組相比,加入IRE1α核酸內切酶抑制劑(STF-083010)處理組的細胞凋亡率顯著下降,ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bax、caspase3 mRNA表達量顯著下降,bcl-2 mRNA表達量顯著上升,加入IP3R通道的抑制劑(2-APB)或STF-083010處理組的細胞內鈣離子濃度均顯著下降。3.亞硝酸鈉急性暴露草魚腎細胞實驗中,細胞活性顯著降低,AO染色結果顯示亞硝酸鈉處理組細胞核和細胞質內熒光強度增強,細胞凋亡率顯著上升,jnk、bax、caspase9、caspase3、ire1α、xbp1s和grp78 mRNA表達量在高濃度亞硝酸鈉暴露后顯著升高。ire1α、xbp1s、grp78 mRNA表達量在低濃度亞硝酸鈉暴露時顯著升高,隨著時間的延長,表達量顯著下降。綜上所述,亞硝酸鹽急性暴露導致草魚應激,造成肝臟組織和鰓組織損傷,肝臟生化指標和抗氧化酶活性發(fā)生顯著性變化,肝臟組織、肝細胞和腎細胞內質網應激IRE1通路和細胞凋亡相關基因的表達顯著升高,肝細胞和腎細胞活性顯著降低,凋亡率顯著升高,肝細胞內鈣離子濃度顯著上升。在亞硝酸鈉暴露引起的草魚肝細胞凋亡中,內質網應激IRE1通路發(fā)揮一定作用。
【圖文】：

PR的目的是減輕ERS，恢復ER穩(wěn)態(tài)，并防止細胞死亡。為了維一些協(xié)調的反應，包括：1）增加了新蛋白質的進入，從而防折疊和超載；2）ER的折疊能力處理錯誤折疊的蛋白質；3）排出，隨后降解蛋白酶體中的蛋白質；4）如果上述步驟不能因為這些反應至少依賴于一部分非轉錄因子，所以信號必須從關mRNA和蛋白質的表達。ERS被激活后機體做出的一種自身保護機制，涉及多種細胞線粒體、核糖體、高爾基體以及細胞核等多種細胞器之間的報道在酵母中出現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)了IRE1（inositol-requiring enzym在真核高等生物中發(fā)現(xiàn)了另外兩條通路，分別為PERK（PRK）和活化轉錄因子6（activating transcription factor-6, ATF6示（圖1）。

2+等，它們具體的途徑如下（圖2）。圖2 內質網應激反應誘導的細胞凋亡途徑（Rasheva and Domiagos 2009）Fig. 2 Apoptosis pathway induced by endoplasmic reticulum stress reaction1.4.1 Caspase12途徑有研究表明，Caspase12在人類基因組中并不存在，原因可能是在進化時丟失了這個基因（Han et al 2009; Fischer et al 2002）。有報道，人體中Caspase4（cysteinylaspartate specific proteinase 4, Caspase4）與Caspase12的同源性最高。在HeLa細胞和神經母細胞瘤中，Caspase4可以代替Caspase12來行使功能（Egger et al 2003）。Caspase12在機體內主要存在的場所是ER，機體發(fā)生應激反應后可以通過Caspase12引發(fā)凋亡反應，并只能通過ERS的途徑來誘導細胞凋亡（Nakagawa et al2000）。在機體正常狀態(tài)下，Caspase12的存在形式是無活性的
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

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