發(fā)布時間：2020-05-26 13:14

【摘要】：本文以半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)為研究對象,采用解剖學、組織切片、電鏡觀察和兩種染色技術(shù)研究了半滑舌鰨消化道的組織結(jié)構(gòu)特征。在認識消化系統(tǒng)組織學結(jié)構(gòu)基礎上,運用RACE方法獲得了半滑舌鰨食欲素(orexin)的全長c DNA序列并對其進行特征性分析,采用實時熒光定量PCR(q PCR)技術(shù)檢測了orexin m RNA在不同胚胎、仔稚幼魚發(fā)育階段和成魚不同組織中的時空表達水平;最后利用原核表達技術(shù)實現(xiàn)了半滑舌鰨orexin A和orexin B成熟肽體外重組表達和生物活性檢測,獲得了具有生物活性的重組蛋白。本研究結(jié)果為揭示半滑舌鰨的攝食調(diào)控機制和開發(fā)健康養(yǎng)殖技術(shù)提供了基礎資料和理論支撐。主要研究結(jié)果如下:1.半滑舌鰨消化道顯微與超微結(jié)構(gòu)研究采用解剖學、組織切片、電鏡觀察和兩種染色技術(shù)研究了半滑舌鰨消化道的組織結(jié)構(gòu)特征,觀察了各部分消化道的顯微和超微結(jié)構(gòu),測定了消化道各部分的黏膜褶皺數(shù)、黏膜褶皺高度、肌肉層(縱肌和環(huán)肌)厚度、黏液細胞相對密度等數(shù)量指標。結(jié)果顯示:消化道可分為口咽腔、食道、食道胃、前腸、后腸等五部分。半滑舌鰨不具備結(jié)構(gòu)特征明顯的胃,攝食后食道后部與腸道連接部形成一個囊狀膨大結(jié)構(gòu),稱之為食道胃;食道前部開始出現(xiàn)杯狀黏液細胞,整個食道以Ⅲ型黏液細胞為主,食道胃中黏液細胞以Ⅲ型為主,前腸黏液細胞以Ⅳ型為主,后腸黏液細胞以Ⅱ型為主。研究結(jié)果為認識半滑舌鰨消化與吸收生理機制及研制人工養(yǎng)殖用飼料提供參考資料。2.半滑舌鰨orexin的基因克隆、組織分布和早期生長發(fā)育表達特性采用RACE方法,首次從半滑舌鰨下丘腦中克隆到orexin c DNA全長序列。c DNA序列全長為734 bp,包括87 bp的5’非編碼區(qū)(UTR)、417 bp的開放閱讀框(ORF)和230 bp的3’非編碼區(qū)(UTR),編碼139個氨基酸的前體蛋白。其中包括36個氨基酸的信號肽,43個氨基酸的orexin A成熟肽、28個氨基酸的orexin B成熟肽、26個C端未知功能的肽段和兩個GKR蛋白水解位點。系統(tǒng)進化分析表明,半滑舌鰨orexin其它鰈形目魚類處于同一分支。定量PCR分析結(jié)果顯示,半滑舌鰨orexin m RNA主要在腦中表達,此外在鰓、食道胃和脾臟中有較高表達,在其它組織中有微量表達,表明其具有廣泛的表達特性。orexin m RNA在胚胎發(fā)育初期階段未檢測到表達,最早在囊胚期檢測到表達,其后隨胚胎發(fā)育進程呈總體升高趨勢,并在胚胎即將孵化出膜期達到峰值。半滑舌鰨orexin m RNA表達水平在1-180日齡內(nèi)隨苗種生長發(fā)育而逐漸升高。上述結(jié)果表明orexin可能在半滑舌鰨胚胎發(fā)育和早期生長過程中中發(fā)揮重要調(diào)控作用。3.半滑舌鰨orexin A和orexin B成熟肽的重組表達及活性分析根據(jù)克隆得到的半滑舌鰨orexin全長序列,設計帶酶切位點引物克隆得到orexin A和orexin B成熟肽序列。利用PCR方法將擴增片段連接到原核表達載體p ET-32a上,得到的重組質(zhì)粒導入到大腸桿菌BL21后經(jīng)IPTG誘導產(chǎn)生N端含His標簽的融合蛋白。預測orexin A重組蛋白大小為24.90 k Da,orexin B重組蛋白大小為21.14k Da。以SDS-PAGE電泳檢測和Sigma Scan軟件分別確定orexin A和orexin B重組蛋白誘導的最佳溫度分別為32°C和37°C、誘導劑濃度和表達時間均為1 mmol/L和6 h,得到的orexin A和orexin B重組蛋白最大表達量分別占細菌總蛋白的52.8%和43.5%,并主要分泌在上清液中。Western blotting免疫印跡表明獲得的重組蛋白可被63His抗體特異性識別。Ni~(2+)-NTA親和層析柱純化獲得了高純度的半滑舌鰨orexin重組蛋白。下丘腦離體孵育實驗表明,獲得的orexin重組蛋白能顯著影響半滑舌鰨下丘腦NPY m RNA、orexin m RNA和NPY肽水平的表達和分泌,表明獲得的重組蛋白具有生物活性。研究結(jié)果可為深入探究orexin在半滑舌鰨生長發(fā)育中的作用機制及研制高效綠色的促攝食制劑提供基礎資料。
【圖文】：

退化為細小尖突；有咽喉齒且較為發(fā)達，有舌，口咽腔后為食道，連接口咽腔和食道胃，較短，長度僅為消化道長度的1/15左右。飽食的半滑舌鰨在食道后方形成一個臨時貯存食物的食道胃（圖2-1），形態(tài)上與食道分界較明顯，往后延伸逐漸變細，與前腸分界不明顯，顏色也無明顯差異。進食消化完成后食道胃明顯變小，長度和直徑與腸道無差異。前腸和后腸直徑和顏色均略有差異，前腸直徑較后腸略大，偏乳白色，，后腸近肛門處直徑變大，腸壁變薄。圖 2-1 半滑舌鰨消化道外部形態(tài)特征示意圖Fig.2-1 The schematic diagram of alimentary canal of Cynoglossus semilaevis2.2 消化道組織學特征食道：組織切片觀察顯示，食道組織分為4層（圖版Ⅰ-2），由內(nèi)向外依次為黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜層。食道黏膜層向食道內(nèi)側(cè)突起形成11～14條縱行褶皺（圖版Ⅰ-1），為黏膜褶皺，平均高度為755.333±95.254 μm（表1）

16 30h00min 胚體全部包卵黃 圖 3-1-1617 32h05min 仔魚孵化出膜圖3-1 半滑舌鰨16個胚胎發(fā)育時期Fig.3-1 16 embryonic developmental stages of Cynoglossus semilaevis注：圖片對應時期見表 3-1Note：For the details of embryonic stage picture, see Tab.3-1.
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2681894