【摘要】：鲆鰈魚類大多為較高緯度分布的重要海水養(yǎng)殖魚類,冬季養(yǎng)殖都面臨著較長的低溫期。其中,大菱鲆Scophthalmus maximus是由歐洲引入我國的海水養(yǎng)殖魚種,-1°C到20°C均可存活,但低于8℃時其生長速率顯著降低。北方養(yǎng)殖中,每年要經(jīng)歷4個月的低溫,使養(yǎng)殖場的生產(chǎn)效益顯著降低。牙鲆Paralichthys olivaceus是中、韓、日三國的重要海水養(yǎng)殖魚類。同樣,冬季的低溫海水影響其生長和存活,進(jìn)而影響其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)出。而有關(guān)鲆鰈魚類的耐低溫研究才剛剛開始,其耐低溫機制、育種連鎖標(biāo)記等研究也幾乎沒有系統(tǒng)報道。本研究對雌核發(fā)育大菱鲆低溫耐受組和敏感組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和miRNA高通量測序,篩選出低溫脅迫下差異表達(dá)基因和miRNA,并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,初步闡釋低溫下的miRNA-TF-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其耐低溫的機制。同時,研究了低溫下牙鲆能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子AMPK及其相關(guān)基因表達(dá)變化,以及細(xì)胞水平上激活劑和抑制劑對該通路的調(diào)控。并在hsp70、hmgb1以及yb-1等耐低溫相關(guān)基因中篩選了牙鲆低溫相關(guān)的SNP。這些結(jié)果將為鲆鰈魚類耐低溫機制闡述與育種研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。具體研究結(jié)果如下:1.雌核發(fā)育的大菱鲆幼魚經(jīng)0°C低溫處理,獲得低溫耐受組(CT)和低溫敏感組(CS)。對其進(jìn)行RNA-seq和miRNA-seq高通量測序和分析。結(jié)果顯示,相對于對照組,低溫耐受組和敏感組對低溫的應(yīng)答在mRNA和miRNA水平上明顯不同,mRNA很多上調(diào),而miRNA的變化較少。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),miRNA-轉(zhuǎn)錄因子-mRNA網(wǎng)絡(luò)參與了細(xì)胞周期、細(xì)胞膜組分、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和晝夜節(jié)律通路的調(diào)控,從而調(diào)控大菱鲆對低溫脅迫的應(yīng)答。2.對牙鲆雌核發(fā)育家系的鰓、肌肉及肝臟等組織在低溫下(0℃)的組織形態(tài)變化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)低溫對鰓的組織結(jié)構(gòu)影響較大,肌肉組織結(jié)構(gòu)幾乎沒有變化,但肝臟組織卻有一定的損傷,呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的趨勢。進(jìn)一步對牙鲆AMPK及其相關(guān)基因低溫脅迫下腦、肌肉和心臟組織中差異表達(dá)圖式進(jìn)行了分析,并在細(xì)胞水平探討了其調(diào)控機制。結(jié)果表明,低溫激活了腦組織中LKB1、CaMKKβ及AMPK基因,AMPK又激活了SITR1、FOXO1A和TFAM;在肌肉組織中,這些基因表達(dá)呈現(xiàn)出先降后升的趨勢,對低溫的應(yīng)答存在滯后現(xiàn)象。在細(xì)胞水平,低溫和激活劑AICAR均激活了AMPK及相關(guān)基因,抑制劑CC抑制了這些基因的表達(dá)。由此可以初步推斷低溫下AMPK的調(diào)控機制:首先低溫脅迫通過Ca~(2+)和AMP/ATP激活了LKB1和CaMKKβ,進(jìn)而激活了AMPK;AMPK又激活了FOXO1A和SIRT1,從而加強糖酵解和線粒體的生物合成,產(chǎn)生更多的能量,并增強抗氧化能力;活化的AMPK同時抑制了HMGCR,使膽固醇生物合成受阻�？偟膩碚f,在低溫脅迫中,AMPK不但參與了能量調(diào)控還參與了對低溫的應(yīng)答。3.對hsp70、hmgb1及yb-1基因部分序列在牙鲆低溫耐受組和敏感組進(jìn)行SNP分子標(biāo)記篩選。分別從hsp70、hmgb1及yb-1獲得了9、21和10個SNP位點。其中,hsp70和hmgb1各有3和2個SNP在低溫耐受組和敏感組之間存在顯著性差異;hsp70基因SNP 8的等位基因G僅出現(xiàn)在耐受組;hmgb1 SNP 7的基因型TT和等位基因T與耐低溫相關(guān),而基因型CC和等位基因C與低溫敏感相關(guān)。單倍型分析發(fā)現(xiàn),hsp70基因的單倍型TTG與牙鲆的耐低溫相關(guān),而hmgb1基因的單倍型ATG和TCT分別與低溫耐受和低溫敏感相關(guān)聯(lián)。
【圖文】：

994 bp, unigene 的長度如圖 2.2。表2.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Table 2.3 Data output quality list of RNA-seq樣品SampleRaw ReadsCleanreadsCleanbases (G)錯誤率Error (%)Q20 (%) Q30 (%)CT_1 39010112 37778852 4.72 0.02 96.16 91.32CT_2 38658504 37495012 4.69 0.02 96.05 91.09CT_3 36561092 35409136 4.43 0.02 96.00 91.00CS_1 34899208 33731654 4.22 0.02 95.82 90.65CS_2 41702880 40027278 5.00 0.02 95.38 89.76CS_3 36461264 35168832 4.40 0.02 95.73 90.44CG_1 35781094 34615484 4.33 0.02 95.80 90.54CG_2 35719578 34575328 4.32 0.02 95.83 90.59CG_3 32298470 31166162 3.90 0.02 95.37 89.49

41圖2.5差異表達(dá)的基因 KEGG 分析Figure 2.5 Pathway classification of differentially expressed genes according to KEGG results
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

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本文編號：2681638