發(fā)布時間：2020-05-21 13:35

【摘要】：非特異性細胞毒性細胞(NCC)是哺乳動物自然殺傷細胞的前體細胞,在魚類先天性免疫中發(fā)揮著重要作用。非特異性細胞毒性細胞受體Ⅰ型(NCCRP-1)是該類細胞膜上關鍵的受體蛋白,是NCC發(fā)揮功能的分子基礎。然而目前對于NCCRP-1介導的NCC活性調控網絡與作用機理還缺乏系統(tǒng)的研究。為揭示魚類NCC活性調控的作用網絡及分子機理,本論文以南方主要養(yǎng)殖品種——尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)為研究對象,從以下三方面開展了研究工作:(一)通過酵母雙雜交文庫法篩選NCCRP-1的互作蛋白,隨后采用點對點酵母雙雜交進行驗證;(二)通過分析鑒定得到的互作蛋白其對NCC的活性調控作用,初步闡明了NCCRP-1介導的NCC活化信號轉導通路;(三)針對發(fā)現(xiàn)的新型激活型配體分子CD80/86的功能以及NCC的效應分子NK-lysin進行了初步探究。取得的主要研究結果如下:1、羅非魚NCCRP-1的表達特征及其互作蛋白的獲取和驗證獲得羅非魚NCCRP-1(On-NCCRP-1)的c DNA序列和基因組序列,并發(fā)現(xiàn)On-NCCRP-1在NCC的全細胞均有分布。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),On-NCCRP-1在羅非魚的肝臟和頭腎組織有較高分布。不同刺激物刺激后,On-NCCRP-1的表達量在各組織及NCC中均出現(xiàn)顯著性上調。結果表明On-NCCRP-1作為NCC受體分子,在介導魚類免疫應答中起著重要作用。根據On-NCCRP-1的基因序列特征分別構建NCCRP-1全長、胞外結合區(qū)域以及胞內轉錄活化區(qū)+信號轉導區(qū)三個酵母雙雜交誘餌質粒,并構建羅非魚頭腎與肝臟酵母雙雜交c DNA文庫。利用三個誘餌載體分別從肝臟和頭腎c DNA文庫中篩選潛在互作蛋白。最終獲取11個與NCCRP-1有潛在相互作用的基因序列片段,最終克隆獲得10個基因的ORF序列。進一步使用酵母雙雜交技術對此10個基因與NCCRP-1進行點對點驗證,發(fā)現(xiàn)On-NCCRP-1可與羅非魚C-type lectin(On-C-type lectin)、羅非魚serotransferrin(On-serotransferrin)相互作用。結果成功獲得兩個胞外蛋白分子可與On-NCCRP-1相互結合。2、依賴于NCCRP-1受體介導的NCC活性調控羅非魚On-C-type lectin具有凝集素家族典型的CRD結構域。q RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),其廣泛分布于羅非魚多個組織,且在肝臟中表達量最高。無乳鏈球菌刺激后,On-C-type lectin在多個組織中均于早期發(fā)生顯著性上調,表明該基因在細菌感染早期的免疫應答中發(fā)揮重要作用。利用On-C-type lectin和On-serotransferrin重組蛋白對體外分離的NCC進行刺激,發(fā)現(xiàn)3 h和6 h均可誘導部分NCC毒性效應分子高表達,表明NCC被激活。同時用誘導3 h的NCC對FHM細胞進行毒性實驗,發(fā)現(xiàn)On-C-type lectin和On-serotransferrin重組蛋白均可有效誘導FHM細胞凋亡信號開啟,而使用抗On-NCCRP-1抗體封閉On-NCCRP-1,可抑制NCC對FHM的殺傷活性。結果表明,On-C-type lectin和On-serotransferrin均可通過受體On-NCCRP-1介導NCC的殺傷活性。酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)On-NCCRP-1可與On-SKP1相互結合,而Skp1-Cul1-F-box protein(SCF)泛素連接酶復合物在催化蛋白泛素化過程中起著重要作用,結果表明On-NCCRP-1可能會介導泛素化作用。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),On-NCCRP-1過表達可激活NF-κB轉錄活性。推測On-NCCRP-1可能與On-SKP1結合后參與泛素化作用,進一步促進NF-κB抑制物IκB的降解,從而有效促進NF-κB信號轉導。3、不依賴于NCCRP-1受體介導的NCC活性調控分析了羅非魚CD80/86基因(On-CD80/86)和CD28基因(On-CD28)的結構特征。q RT-PCR結果顯示,On-CD28和On-CD80/86可在羅非魚各組織中檢測到,且分別在胸腺和心臟中表達量最高。無乳鏈球菌刺激后,On-CD28和On-CD80/86在多種組織中表達量均顯著上調。然而,對頭腎組織淋巴細胞刺激后發(fā)現(xiàn),On-CD28和On-CD80/86表現(xiàn)出不同的表達特征。體外互作實驗表明On-CD80/86可與On-CD28相互作用,但不能和On-NCCRP-1相結合。且發(fā)現(xiàn)On-CD80/86不依賴于受體NCCRP-1介導即可誘導NCC效應分子的表達,以及提高NCC對CIK細胞的殺傷作用。以上結果表明On-CD80/86與On-CD28互作為羅非魚T細胞活化提供共刺激信號,而On-CD80/86也可能是一種不依賴于On-NCCRP-1受體的新型NCC激活型配體,在羅非魚抵抗病原微生物感染時提供重要幫助。4、NCC效應分子NK-lysin的序列分析及其功能研究本研究首先從羅非魚體內克隆獲得鞘脂激活樣蛋白直系同源物NK-lysin(On-NKL)。q RT-PCR的結果表明On-NKL存在于羅非魚的多種組織以及頭腎淋巴細胞和NCC中,且在鰓中表達量最高。無乳鏈球菌刺激后,On-NKL在羅非魚的頭腎、腦、脾臟、體腎、腸以及NCC中的表達模式都呈現(xiàn)出時間依賴性的關系。On-NKL過表達組的羅非魚脾臟組織中的細菌定植量顯著低于對照組,同時發(fā)現(xiàn),對于攻毒后的20天內On-NKL過表達組的羅非魚死亡率明顯低于對照組,結果表明On-NKL可能是魚類NCC的潛在效應分子,在魚類抗細菌感染過程中起著重要作用。
【圖文】：

2.2 結果與分析2.2.1 On-NCCRP-1 序列分析獲取的 On-NCCRP-1 的 cDNA 全長 1045 bp（GenBank 登錄號：MF162296），On-NCCRP-1 包括 90 bp 的 5`非翻譯區(qū)（UTR），702 bp 的 ORF 編碼 233 aa，253 bp的 3`UTR，以及假定的聚腺苷酸化信號（AATAAA）位于其 poly（A）尾部上游 17-21bp 處（圖 2-1）。預測的 MW 為 26.55 kDa，理論 pI 為 5.76。軟件分析表明（用 SignalP程序和TMHMM），On-NCCRP-1沒有信號肽或跨膜區(qū)，多序列比對發(fā)現(xiàn)，On-NCCRP-1與其他物種的序列同源性介于 55 %~85 %之間。在 N-末端含有稱為“box-1（”PxPxxP）和“box-2”（PxP）的富含脯氨酸的基序（PRM）像其他魚 NCCRP-1，，所有 NCCRP-1從 魚 檢 查 具 有 的 F-box 相 關 （ FBA ） 結 構 域 以 及 推 定 的 抗 原 識 別 位 點（LPxxxWFxxEQxVxLKA）在各魚當中都較為保守。On-NCCRP-1 基因組序列全長4471 bp，含有 6 個外顯子和五個內含子。

圖 2-2 On-NCCRP-1 氨基酸序列與其它已知的 NCCRP-1 序列的多序列比對氨基酸殘基用黑色背景表示; 氨基酸殘基一致性≥75%用灰色表示; 每條氨基酸序列末尾的百表 NCCRP-1 氨基酸序列與其的同源性.igure 2-2 Alignment of deduced amino-acid sequences of On-NCCRP-1 homologsensus residues are in black. Residues that are ≥75% identical among aligned sequences are in grey.llowing each amino-acid sequence represents overall sequence identity between On-NCCRP-1 and sequences.圖 2-3 各物種 NCCRP-1 內含子/外顯子結構圖示方框代表外顯子; 線條代表內含子; 數字代表相應的核苷酸長度; 黑色方框分別代表 5`和 3`Uure 2-3 NCCRP-1 intron/exon organization along with different NCCRP-1 struc
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2674380