【摘要】：斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)是我國沿海地區(qū)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。本課題組在近十幾年攻克了斑節(jié)對蝦難以人工繁育的難題,成功實(shí)現(xiàn)了斑節(jié)對蝦的全人工繁育。但對該過程中親蝦的性腺發(fā)育和內(nèi)分泌調(diào)控成熟機(jī)理了解的不充分,制約了全人工繁育技術(shù)的升級。為此,開展基于小肽類激素調(diào)控斑節(jié)對蝦性腺發(fā)育機(jī)理的研究,將有助于解決上述問題。其中,由脊椎動物下丘腦合成分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是一種十肽激素,通過與GnRH受體(GnRHR)結(jié)合激活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控促成熟激素的合成分泌,調(diào)控脊椎動物的性腺發(fā)育成熟過程。目前已有相關(guān)研究已經(jīng)證明斑節(jié)對蝦的神經(jīng)系統(tǒng)中存在GnRH,但其如何與GnRHR共同調(diào)控斑節(jié)對蝦性腺成熟發(fā)育的相關(guān)研究還比較缺乏,因此本研究通過構(gòu)建斑節(jié)對蝦成熟前后卵巢和神經(jīng)組織的轉(zhuǎn)錄組文庫了解不同卵巢發(fā)育期的基因差異表達(dá)變化,從中篩選GnRH及其受體的候選基因;同時(shí)采用體外組織原代培養(yǎng)、原核表達(dá)GnRH體內(nèi)注射等方法確定GnRH類似物對斑節(jié)對蝦性腺成熟發(fā)育的調(diào)控作用。具體研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了斑節(jié)對蝦雌蝦卵巢及神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組文庫收集斑節(jié)對蝦處于不同發(fā)育時(shí)期的雌蝦樣品,利用Illumina Hi SeqTM高通量測序技術(shù)構(gòu)建了雌蝦卵巢、神經(jīng)組織的轉(zhuǎn)錄組文庫。6個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫共獲得了44.63 G的數(shù)據(jù),原始序列經(jīng)聚類組裝后產(chǎn)生了246206個(gè)transcripts,125806個(gè)Genes。與七大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對及功能注釋后,共發(fā)現(xiàn)了7728個(gè)Genes可以得到明確注釋。在卵巢不同發(fā)育階段的比較轉(zhuǎn)錄組中,發(fā)現(xiàn)了56個(gè)差異表達(dá)基因,在不同卵巢發(fā)育階段的神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)164個(gè)差異表達(dá)基因,不同時(shí)期卵巢及神經(jīng)組織之間共發(fā)現(xiàn)6912個(gè)差異表達(dá)基因。(2)探究了斑節(jié)對蝦G蛋白偶聯(lián)受體基因的功能作用通過轉(zhuǎn)錄組文庫篩選獲得激素受體候選基因:G蛋白偶聯(lián)受體基因,并對其基因特性及表達(dá)特性進(jìn)行研究。經(jīng)過生物信息學(xué)分析確定,Pm GPCR蛋白具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(7TM)和DRY基序,屬于類視紫紅質(zhì)受體家族。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也表明Pm GPCR與Pc GPCR(克氏原鰲蝦)匯為一支。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,Pm GPCR基因在不同發(fā)育階段、蛻皮過程、細(xì)菌刺激、氨氮脅迫后表達(dá)變化。(3)優(yōu)化了斑節(jié)對蝦性腺組織細(xì)胞原代培養(yǎng)的條件探索使用三種改良型培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并對組織分別進(jìn)行機(jī)械分離和酶消化的培養(yǎng)方法處理后的細(xì)胞生長狀態(tài)及活力、相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離法適用于觀察組織變化情況且易于操作,酶消化法適用于觀察單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)變化、蛋白定位等實(shí)驗(yàn)。而通過觀察細(xì)胞生長的情況及HE染色后性腺組織的切片及三種培養(yǎng)基中的細(xì)胞活力值,發(fā)現(xiàn)酶解法更適用于斑節(jié)對蝦性腺細(xì)胞的離體培養(yǎng),1號或2號培養(yǎng)基在特定的培養(yǎng)條件下效果更優(yōu)于3號培養(yǎng)基,培養(yǎng)時(shí)間在3d左右為宜,c-Mos基因的表達(dá)情況與斑節(jié)對蝦離體組織/細(xì)胞的生長情況呈正相關(guān)。(4)GnRH類似物對體外培養(yǎng)性腺組織/細(xì)胞的作用采用離體性腺細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法研究了章魚促性腺激素釋放激素類似物(Oct GnRH)、克氏原螯蝦促性腺激素釋放激素類似物(Pc GnRH)、羅氏沼蝦促性腺激素釋放激素類似物(Mro GnRH),以及多種神經(jīng)組織對斑節(jié)對蝦性腺發(fā)育的作用效果。結(jié)果表明:50 ng·ml-1 Oct GnRH對離體雌雄蝦的性腺發(fā)育有明顯的作用,顯著增大卵母細(xì)胞的直徑(P0.01),50 ng·m L-1 Oct GnRH、500 ng·m L-1 Pc GnRH及腦神經(jīng)處理后的雌蝦離體卵巢的卵黃蛋白原積累量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長顯著增加。因此確定選擇章魚GnRH的序列進(jìn)行體外重組蛋白的表達(dá)。(5)活體注射GnRH類似物對斑節(jié)對蝦性腺成熟的影響將章魚GnRH類似物的氨基酸核心序列以多拷貝的形式插入p GEX-2T表達(dá)質(zhì)粒,通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶性表達(dá)的8拷貝(8Oct GnRH-p GEX-2T)及16拷貝(16Oct GnRH-p GEX-2T)的融合蛋白,經(jīng)GST標(biāo)簽親和純化獲得純化的融合蛋白。將8拷貝Oct GnRH、16拷貝Oct GnRH融合蛋白及化學(xué)合成的Oct GnRH、Pc GnRH多肽對成熟前期的雌雄斑節(jié)對蝦進(jìn)行體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明16拷貝Oct GnRH性腺指數(shù)在實(shí)驗(yàn)到達(dá)最后階段時(shí)顯著升高。Vg基因的表達(dá)規(guī)律與斑節(jié)對蝦的發(fā)育成熟規(guī)律相符,而GnRHR的表達(dá)規(guī)律暗示斑節(jié)對蝦體內(nèi)可能含有第二種GnRHR,為進(jìn)一步探究GnRHR的存在奠定了基礎(chǔ),CREB及c-JUN基因的表達(dá)規(guī)律則反映出斑節(jié)對蝦體內(nèi)同樣存在GnRH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,且調(diào)控過程具有多樣性和復(fù)雜性,需要進(jìn)行更加深入的研究。
【圖文】：

圖 1-1 斑節(jié)對蝦卵巢結(jié)構(gòu)示意圖e structure map of ovary of Penae育是同時(shí)啟動的，，原生殖細(xì)胞發(fā)境中，卵巢的發(fā)育成熟需要 10形態(tài)特征的變化將整個(gè)過程分）、Ⅲ期（周邊核仁期）、Ⅳ期）[4]。具體特征如表 1-1： 1-1 斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育各期特征s of ovarian development at every 顏色 切片觀察 無色/白色 卵巢壁較厚，腔大

組織易碎，部分卵母細(xì)胞開始重新發(fā)育�！�1.1.2 雄蝦的生殖系統(tǒng)雄蝦的生殖系統(tǒng)共包括精巢、輸精管、貯精囊及交接器 4 個(gè)部分組成（如圖1-2）。精巢也為左右兩側(cè)對稱的結(jié)構(gòu)，左右各有 8 葉，緊貼于心臟和肝胰腺上，未成熟時(shí)為透明狀，成熟時(shí)為半透明的乳白色。精巢內(nèi)部還含有大量的生精小管，管腔上有生殖帶及精原細(xì)胞群，后期發(fā)育成精細(xì)胞。從精巢的尾部兩側(cè)各發(fā)出一條彎曲折疊的輸精管，可分為近端輸精管（Proximal vas deferens，PVD）、中端輸精管（Middle vas deferens，MVD）和遠(yuǎn)端輸精管（Distal vas deferens，DVD）[5]。近端輸精管較細(xì)，中端輸精管為一段膨大一段纖細(xì)的結(jié)構(gòu)，遠(yuǎn)端輸精管整體較細(xì)，尤其在靠近貯精囊處會進(jìn)一步變細(xì)，尾部即與壺腹部/貯精囊相連。壺腹部呈橢圓型，成熟時(shí)會生長有精莢。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2670720