【摘要】：石斑魚廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域,是我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類。然而在石斑魚繁育生產(chǎn)過程中,病毒性神經(jīng)壞死病(VNN)常引起石斑魚仔稚魚發(fā)生大規(guī)模死亡事件,死亡率常高達(dá)90%。VNN目前并沒有有效的防治措施,而中草藥具有低毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn),符合開發(fā)無(wú)公害漁藥的特點(diǎn),因此篩選抗神經(jīng)壞死病毒(NNV)的中草藥具有廣闊的應(yīng)用前景。在藥物篩選的載體選擇中,細(xì)胞系取自于生物體,生物性能基本接近生物個(gè)體特性,相比其他藥物篩選載體,細(xì)胞系可進(jìn)行高通量篩選,符合現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。故利用魚類細(xì)胞系篩選抗NNV中草藥具有一定的實(shí)踐和理論價(jià)值。2013年5月份,山東省某繁育場(chǎng)培育的珍珠龍膽石斑魚魚苗由于感染了NNV而出現(xiàn)了大量死亡,給該繁育場(chǎng)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本論文對(duì)導(dǎo)致魚苗患病死亡的病原進(jìn)行了鑒定及測(cè)序分析,并利用健康珍珠龍膽石斑魚的腦組織進(jìn)行了細(xì)胞系建系工作,初步探討了該細(xì)胞系與NNV的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,又利用建立的腦組織PB細(xì)胞系和SSN-1細(xì)胞系進(jìn)行了抗NNV中草藥的篩選工作。本論文有如下主要研究結(jié)果:1疾病病原鑒定及基因測(cè)序分析該疾病暴發(fā)的主要流行病學(xué)特點(diǎn)為:患病珍珠龍膽石斑魚體色發(fā)黑,厭食,死亡率達(dá)90%以上,具有一定的季節(jié)性。組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明患病魚體腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)及視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)大量的空泡化壞死病變。電鏡切片觀察到在神經(jīng)組織中含有大量的20-30nm的病毒顆粒,呈晶格狀排列在細(xì)胞質(zhì)中。另外,使用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的檢測(cè)NNV的PCR引物,成功的擴(kuò)增出特異性條帶(421bp)。結(jié)合該疾病的流行病學(xué),患病魚體的組織病理學(xué),及分子生物學(xué)確診了導(dǎo)致此次珍珠龍膽石斑魚魚苗患病死亡的病原體為NNV。在確定致病病原的基礎(chǔ)上,利用四對(duì)引物成功的擴(kuò)增出NNV含有的RNA1和RNA2的基因序列,并上傳到Gen Bank中(獲得的登陸號(hào)分別為:KF668184、KF668183),利用DNA star軟件分析后表明此RNA1和RNA2的開放閱讀框(ORF)分別編碼982和338個(gè)氨基酸。其基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明該分離獲取的NNV基因型屬于RGNNV型。該基因型為我國(guó)內(nèi)陸常見基因型,為后續(xù)的藥物篩選提供了典型的病毒來源。2細(xì)胞系建立及對(duì)NNV的敏感性為了盡可能的排除不同來源病毒株在感染魚體過程中的宿主特異性,本研究直接利用健康珍珠龍膽石斑魚的腦組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并成功建系暫命名為PB細(xì)胞系。通過對(duì)PB細(xì)胞系生長(zhǎng)條件(FBS含量、生長(zhǎng)因子)的研究表明該細(xì)胞系在含有微量b FGF因子和10%FBS的1.5×L-15細(xì)胞培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)良好。使用一定量的病毒粗提液添加到該細(xì)胞系后,雖然沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞皺縮、變圓、脫落等典型的細(xì)胞病變(CPE),但細(xì)胞經(jīng)Hoechst染色后,細(xì)胞核出現(xiàn)了一定程度的顆粒濃染現(xiàn)象,表明了病毒對(duì)該細(xì)胞系有一定的影響,細(xì)胞出現(xiàn)了輕微的退性病變,但表現(xiàn)在細(xì)胞總體上的CPE,并不明顯。后續(xù)進(jìn)行的相對(duì)熒光定量結(jié)果也表明了NNV在細(xì)胞中有一定的增殖。本試驗(yàn)成功建立的PB細(xì)胞系增加了現(xiàn)存有限魚類細(xì)胞系的數(shù)量及種類,而NNV與PB細(xì)胞系之間的相互作用為研究病毒與宿主之間的關(guān)系提供了一定的理論參考。3抗NNV中草藥的篩選通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得50種具有抗病毒作用的中草藥,采取傳統(tǒng)的煎煮法粗提制備,5倍稀釋后,檢測(cè)對(duì)SSN-1細(xì)胞系的大致安全濃度。在各中草藥安全濃度下與一定量的病毒粗體液在4℃下混合處理24小時(shí)。加入SSN-1細(xì)胞系中,7天后觀察SSN-1細(xì)胞系出現(xiàn)的CPE差異。利用CPE差異篩選出6種相對(duì)有效的中草藥,分別對(duì)應(yīng)的編號(hào)為H-15,H-22,H-27,H-33,H-37,H-45。此外,檢測(cè)了H-15,H-22,H-27,H-33,H-37,H-45中草藥對(duì)PB細(xì)胞系的安全濃度,并在安全濃度下與病毒粗提液混合處理作用于PB細(xì)胞系,用于NNV用藥后在PB細(xì)胞中的相對(duì)熒光定量測(cè)定。結(jié)果表明,編號(hào)為H-15,H-22,H-27,H-33,H-37,H-45的中草藥對(duì)NNV的增殖有一定的抑制作用。本部分研究結(jié)果為NNV引起的VNN的防控提供了一定的參考性藥物,具有一定的實(shí)踐生產(chǎn)意義。
【圖文】：

圖 2-1 患病石斑魚魚苗Figure 2-1 Infected grouper fingerlings.2 光鏡樣品處理方法取 10 尾癥狀典型的患病魚苗和 10 尾正常魚苗放入提前配好的 Davidison中固定。24 小時(shí)后，把固定的魚苗置換到 70%乙醇中。隨后，經(jīng)過一系列于 Nikon E800 光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行正常魚體及患病魚體觀察。處理程序如下in 70%乙醇，30 min 85%乙醇，20 min 95% 乙醇，30 min 95% 乙醇，20 min 1醇，30 min 100 % 乙醇脫水后，經(jīng) 20 min 二甲苯，15min 二甲苯，15min處理后，放置于石蠟中進(jìn)行透蠟。包埋、切片后進(jìn)行染色。染色程序?yàn)椋?甲苯，10 min 二甲苯，2 min 100% 乙醇，2 min 100% 乙醇，3 min 95% 乙 min 80% 乙醇，，2 min 80% 乙醇，2 min 50% 乙醇，2 min 蒸餾水，4:15 m精，8 min Wash 4，1min 伊紅，10s Wash，2 min 95%乙醇，2min 95%乙醇，00%乙醇，3min 100%乙醇，2min 二甲苯，2min 二甲苯，2min 二甲苯。染

2.1 組織病理觀察組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在患病石斑魚魚苗的大腦和視網(wǎng)膜組織中含有大量細(xì)胞空泡，且受感染的組織出現(xiàn)壞死、脫落現(xiàn)象。而在正常魚體的腦和視網(wǎng)膜并未發(fā)現(xiàn)空泡和組織脫離現(xiàn)象，且各部分細(xì)胞間界限分明清晰（圖 2-2）
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S948

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2669631