【摘要】：魚類出血性敗血癥(Septicemia)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的流行病,隨著集約化模式的發(fā)展以及水環(huán)境的嚴(yán)重惡化,由氣單胞菌屬(Aeromonas)感染導(dǎo)致的爆發(fā)性出血病癥狀極為嚴(yán)重,該病發(fā)病時(shí)間短、致死率高,帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重的阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究擬通過病原物的分離、鑒定及致病性的綜合分析,推測其致病機(jī)理。在此基礎(chǔ)上,將益生菌添加到魚類飼料中應(yīng)用到草魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)中,檢測益生菌發(fā)酵飼料對細(xì)菌感染后草魚的抗病能力,以探討益生菌作為免疫刺激劑在防御出血性疾病中的作用。主要研究如下:從新鄉(xiāng)市某魚塘采集具有該病病癥的草魚樣本,取患病皮膚、肝、脾和腸等組織,經(jīng)初篩、復(fù)篩后得4株純化的病原菌,16S rDNA的鑒定后分別為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、腐敗希瓦氏菌(Shewanella sp.)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)。將四種菌株分別對健康草魚進(jìn)行回歸感染,通過患病癥狀得出維氏氣單胞菌是致草魚發(fā)病的主要菌株,并將其作為目標(biāo)菌株進(jìn)行毒性效應(yīng)的研究。以氣溶素、腸毒素和外膜蛋白三種毒力基因作為靶向基因,得出維氏氣單胞菌較其他三株菌毒力基因表達(dá)明顯;將目標(biāo)菌株對健康草魚進(jìn)行急性毒性研究得:96 h半致死濃度為3.6×10~4 CFU/mL,安全濃度為9.11×10~3 CFU/mL。以濃度1.82×10~5、2.81×10~6、1.82×10~8 CFU/mL的菌懸液腹腔注射感染草魚48 h和以濃度為2.81×10~6 CFU/mL的菌懸液感染24 h、48 h、72 h、96 h,分別提取草魚各組織器官的總RNA,通過RT-qPCR方法檢測IL-8和TNF-α基因表達(dá)變化,分析病原菌感染后炎癥相關(guān)基因與草魚腸道炎癥的關(guān)聯(lián)性,結(jié)果表明經(jīng)病原菌感染后草魚各組織mRNA水平的IL-8和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平較對照組均不程度的提高。以濃度1.82×10~5、2.81×10~6、1.125×10~7、1.82×10~8 CFU/mL的菌懸液感染草魚,檢測不同感染時(shí)間時(shí)血清和肝組織中琥珀酸脫氫酶、溶菌酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶五種指標(biāo)的變化。結(jié)果證明病原菌感染后能使血清中ALT、SDH、lysozyme和AKP酶活力顯著提高,同時(shí)高濃度組顯著高于對照組(p0.05);PK酶活力在感染96h時(shí)高濃度組相較對照組酶活力顯著降低(p0.05)。肝組織中PK、ALT和AKP酶活力表現(xiàn)出隨著感染濃度提高顯著提高的現(xiàn)象(p0.05)。以濃度1.82×10~5 CFU/mL的益生菌(保加利亞乳桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌)按3%噴灑到普通飼料上,飼喂病原菌感染后的草魚,結(jié)果顯示益生菌發(fā)酵飼料使病原菌感染后的草魚肝臟、腎臟和腸道組織中的IL-8表達(dá)顯著高于飼喂基礎(chǔ)飼料(p0.05);同時(shí),肝臟、皮膚、脾臟和腸道組織的TNF-α的表達(dá)量顯著高于飼喂基礎(chǔ)飼料(p0.05)。與對照組相比,飼喂16天時(shí),血清AKP和ALT酶活性顯著高于對照組(p0.05);同時(shí),PK、SDH和lysozyme酶活性隨著飼喂時(shí)間的延長作用不顯著(p0.05)。飼喂益生菌發(fā)酵料的草魚死亡率顯著低于飼喂基礎(chǔ)料組,即益生菌發(fā)酵料能顯著提高病原菌感染后草魚的存活率。結(jié)果得出益生菌發(fā)酵飼料能夠提高魚類抵抗力、降低由病原菌感染的發(fā)病率,此結(jié)果對于益生菌改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境作用方面提供了良好的參考。天然免疫刺激劑是一個(gè)有前景的領(lǐng)域因?yàn)樗鼈兪强缮锝到獠⑶揖哂猩锵嗳菪?同時(shí)對環(huán)境和人類健康都是安全的。因此益生菌發(fā)酵飼料應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病的控制乃至疫苗的開發(fā)提供了理論依據(jù),為改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境方面帶來了新的方式。
【圖文】：

19圖2-1 菌株的光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察Figure 2-1Morphological observation of strains under light microscope2.3.2 分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建4 種菌株經(jīng)電泳后大小均為 1500bp 左右，將膠回收產(chǎn)物送往上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸序列的同源性分析，在 MEGA 6.0 分析軟件將 4 種菌株的 16SrDNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)分析和比較構(gòu)建樹狀圖，結(jié)果見圖 2-2。將測序結(jié)果經(jīng)NCBI 比對得出 1 號菌株與維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)同源性達(dá) 99%，2 號菌株與為腐敗希瓦氏菌(Shewanella sp.)同源性達(dá)98%，3號菌株與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)同源性達(dá) 98%，4 號菌株殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)同源性達(dá) 98%。圖 2-2 純化的病原菌16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fi

圖2-1 菌株的光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察Figure 2-1Morphological observation of strains under light microscope2.3.2 分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建4 種菌株經(jīng)電泳后大小均為 1500bp 左右，，將膠回收產(chǎn)物送往上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸序列的同源性分析，在 MEGA 6.0 分析軟件將 4 種菌株的 16SrDNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)分析和比較構(gòu)建樹狀圖，結(jié)果見圖 2-2。將測序結(jié)果經(jīng)NCBI 比對得出 1 號菌株與維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)同源性達(dá) 99%，2 號菌株與為腐敗希瓦氏菌(Shewanella sp.)同源性達(dá)98%，3號菌株與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)同源性達(dá) 98%，4 號菌株殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)同源性達(dá) 98%。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S943

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本文編號：2667990