【摘要】：魚類出血性敗血癥(Septicemia)是我國水產養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的流行病,隨著集約化模式的發(fā)展以及水環(huán)境的嚴重惡化,由氣單胞菌屬(Aeromonas)感染導致的爆發(fā)性出血病癥狀極為嚴重,該病發(fā)病時間短、致死率高,帶來了巨大的經濟損失,嚴重的阻礙了水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究擬通過病原物的分離、鑒定及致病性的綜合分析,推測其致病機理。在此基礎上,將益生菌添加到魚類飼料中應用到草魚的養(yǎng)殖生產中,檢測益生菌發(fā)酵飼料對細菌感染后草魚的抗病能力,以探討益生菌作為免疫刺激劑在防御出血性疾病中的作用。主要研究如下:從新鄉(xiāng)市某魚塘采集具有該病病癥的草魚樣本,取患病皮膚、肝、脾和腸等組織,經初篩、復篩后得4株純化的病原菌,16S rDNA的鑒定后分別為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、腐敗希瓦氏菌(Shewanella sp.)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)。將四種菌株分別對健康草魚進行回歸感染,通過患病癥狀得出維氏氣單胞菌是致草魚發(fā)病的主要菌株,并將其作為目標菌株進行毒性效應的研究。以氣溶素、腸毒素和外膜蛋白三種毒力基因作為靶向基因,得出維氏氣單胞菌較其他三株菌毒力基因表達明顯;將目標菌株對健康草魚進行急性毒性研究得:96 h半致死濃度為3.6×10~4 CFU/mL,安全濃度為9.11×10~3 CFU/mL。以濃度1.82×10~5、2.81×10~6、1.82×10~8 CFU/mL的菌懸液腹腔注射感染草魚48 h和以濃度為2.81×10~6 CFU/mL的菌懸液感染24 h、48 h、72 h、96 h,分別提取草魚各組織器官的總RNA,通過RT-qPCR方法檢測IL-8和TNF-α基因表達變化,分析病原菌感染后炎癥相關基因與草魚腸道炎癥的關聯性,結果表明經病原菌感染后草魚各組織mRNA水平的IL-8和TNF-α轉錄水平較對照組均不程度的提高。以濃度1.82×10~5、2.81×10~6、1.125×10~7、1.82×10~8 CFU/mL的菌懸液感染草魚,檢測不同感染時間時血清和肝組織中琥珀酸脫氫酶、溶菌酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶五種指標的變化。結果證明病原菌感染后能使血清中ALT、SDH、lysozyme和AKP酶活力顯著提高,同時高濃度組顯著高于對照組(p0.05);PK酶活力在感染96h時高濃度組相較對照組酶活力顯著降低(p0.05)。肝組織中PK、ALT和AKP酶活力表現出隨著感染濃度提高顯著提高的現象(p0.05)。以濃度1.82×10~5 CFU/mL的益生菌(保加利亞乳桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌)按3%噴灑到普通飼料上,飼喂病原菌感染后的草魚,結果顯示益生菌發(fā)酵飼料使病原菌感染后的草魚肝臟、腎臟和腸道組織中的IL-8表達顯著高于飼喂基礎飼料(p0.05);同時,肝臟、皮膚、脾臟和腸道組織的TNF-α的表達量顯著高于飼喂基礎飼料(p0.05)。與對照組相比,飼喂16天時,血清AKP和ALT酶活性顯著高于對照組(p0.05);同時,PK、SDH和lysozyme酶活性隨著飼喂時間的延長作用不顯著(p0.05)。飼喂益生菌發(fā)酵料的草魚死亡率顯著低于飼喂基礎料組,即益生菌發(fā)酵料能顯著提高病原菌感染后草魚的存活率。結果得出益生菌發(fā)酵飼料能夠提高魚類抵抗力、降低由病原菌感染的發(fā)病率,此結果對于益生菌改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境作用方面提供了良好的參考。天然免疫刺激劑是一個有前景的領域因為它們是可生物降解并且具有生物相容性,同時對環(huán)境和人類健康都是安全的。因此益生菌發(fā)酵飼料應用于水產養(yǎng)殖中疾病的控制乃至疫苗的開發(fā)提供了理論依據,為改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境方面帶來了新的方式。
【圖文】：

19圖2-1 菌株的光學顯微鏡形態(tài)觀察Figure 2-1Morphological observation of strains under light microscope2.3.2 分子生物學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建4 種菌株經電泳后大小均為 1500bp 左右，將膠回收產物送往上海生工進行測序，測序結果在 NCBI 數據庫中進行核苷酸序列的同源性分析，在 MEGA 6.0 分析軟件將 4 種菌株的 16SrDNA 序列進行系統(tǒng)分析和比較構建樹狀圖，結果見圖 2-2。將測序結果經NCBI 比對得出 1 號菌株與維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)同源性達 99%，2 號菌株與為腐敗希瓦氏菌(Shewanella sp.)同源性達98%，3號菌株與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)同源性達 98%，4 號菌株殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)同源性達 98%。圖 2-2 純化的病原菌16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)進化樹Fi

圖2-1 菌株的光學顯微鏡形態(tài)觀察Figure 2-1Morphological observation of strains under light microscope2.3.2 分子生物學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建4 種菌株經電泳后大小均為 1500bp 左右，，將膠回收產物送往上海生工進行測序，測序結果在 NCBI 數據庫中進行核苷酸序列的同源性分析，在 MEGA 6.0 分析軟件將 4 種菌株的 16SrDNA 序列進行系統(tǒng)分析和比較構建樹狀圖，結果見圖 2-2。將測序結果經NCBI 比對得出 1 號菌株與維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)同源性達 99%，2 號菌株與為腐敗希瓦氏菌(Shewanella sp.)同源性達98%，3號菌株與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)同源性達 98%，4 號菌株殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)同源性達 98%。
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S943

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本文編號：2667990