【摘要】：LGR8是胰島素樣因子3(INSL-3)在體內(nèi)的特異性受體,屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)大家族。哺乳動(dòng)物中LGR8高表達(dá)于睪丸引帶等組織;在人類研究中發(fā)現(xiàn)編碼LGR8和INSL-3的兩個(gè)基因分別控制著哺乳動(dòng)物雄性器官下降所必需的腹股溝韌帶和索狀引帶的分化發(fā)育。目前一般認(rèn)為,LGR8或INSL-3的突變有可能導(dǎo)致隱睪癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)半滑舌鰨全基因組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上,通過RACE的方法克隆得到了半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)LGR8基因全長(zhǎng),該基因全長(zhǎng)為2768bp,共編碼734個(gè)氨基酸。對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,在成熟性腺中,LGR8在雄性中主要在腦、性腺中表達(dá);在雌魚體內(nèi)各組織中表達(dá)無顯著差異,且雄魚性腺和腦中的表達(dá)量要顯著高于雌魚;通過對(duì)不同時(shí)期的性腺進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,LGR8基因在魚體發(fā)育80天左右表達(dá)量開始上升,150d~210d表達(dá)量達(dá)到最大,這表明LGR8在半滑舌鰨性別決定和性腺發(fā)育中起到一定的作用。CSW3是本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)半滑舌鰨基因組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上克隆得到的半滑舌鰨特有且在雌性性腺中高表達(dá)的基因,我們通過RACE技術(shù)克隆得到了半滑舌鰨CSW3基因c DNA全長(zhǎng)。CSW3 c DNA基因全長(zhǎng)為1714bp,其中5端非翻譯區(qū)長(zhǎng)173bp,3端非翻譯區(qū)長(zhǎng)929bp,編碼區(qū)為612bp,編碼共204個(gè)氨基酸。通過定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CSW3基因?yàn)榻M織廣譜性表達(dá),且在卵巢中表達(dá)最高。實(shí)驗(yàn)通過分析CSW3重組蛋白注射性腺后Dmrt1、Sox9、Amh、P450等性別決定相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控,探討CSW3在半滑舌鰨性別決定與分化中的作用。重組蛋白注射半滑舌鰨性腺后實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示,Dmrt1、Sox9、Amh、P450等基因的表達(dá)量有不同程度的上調(diào)和下調(diào),證明了CSW3蛋白具有一定的活性,可能一定程度上在性別決定中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖 2-1 半滑舌鰨雌雄魚個(gè)體性腺細(xì)胞(A 為雄魚，B 為雌魚)Fig 2-1 The natural ovary and testis in half smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis).4.4.2 PCR 驗(yàn)證遺傳性別用合成的性別鑒定引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系為 15.0μL。PCR 結(jié)束后通糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，遺傳雄性為一條帶，遺傳雌性為兩條帶(具體實(shí)驗(yàn)步驟參考本.4.1.1 和 2.4.1.2)。.4.5 LGR8 基因?qū)崟r(shí)定量 PCR 表達(dá)分析實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是指在 PCR 反應(yīng)過程中加入帶熒光物質(zhì)，使其結(jié)合在 DNA 雙定位置上，利用熒光信號(hào)的大小實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 進(jìn)程和反應(yīng)量的變化，再通過制作標(biāo)對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)０鍖?shí)現(xiàn)定量分析的方法。根據(jù)得到的半滑舌鰨 LGR8 基因的編碼區(qū)序列，， 對(duì)表達(dá)分析引物 1339 LGR8-F 和 1476 LGR8-R 詳見表 2-1 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR (ReaCR)。以 β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。實(shí)驗(yàn)將 3 齡半滑舌鰨不同組織，包括腦、腸、腎、心臟、脾臟、血液進(jìn)行了定量分析，同時(shí)對(duì)不同時(shí)期半滑舌鰨性腺，包括

小方框內(nèi)為翻譯起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，長(zhǎng)方框內(nèi)為 7tm-1 結(jié)構(gòu)域，下劃線為 LDL-A 區(qū)域，為 LRRs 區(qū)域Fig.2-2 ORF sequence and deduced amino acid sequence of LGR8 in half smooth tongue-sole. Tlocus (ATG) and the terminal locus (TGA) are boxed in the short frame and the 7tm-1 motif is boxlong frame. LDL-A is underlined. The LRRs sequences are indicated in the shadow.
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2667678