【摘要】：擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國重要的海水養(yǎng)殖經濟蟹類之一。近年來,青蟹的人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大,但在青蟹的人工育苗和養(yǎng)殖過程中因容易受水質、微生物感染等導致存活率仍較低,同時養(yǎng)殖業(yè)抗生素藥品的大量使用使病原微生物的耐藥性不斷增加,這些都極大地限制了產業(yè)的發(fā)展。因此對青蟹免疫機制的研究具有十分重要的意義。酚氧化酶系統(tǒng)是無脊椎動物特有的一套非自身識別免疫系統(tǒng),尤其是在節(jié)肢動物的免疫機制中具有非常重要的作用。血藍蛋白是一類在節(jié)肢動物和軟體動物中負責運輸氧氣的含銅呼吸蛋白。近年來很多研究表明節(jié)肢動物的血藍蛋白和酚氧化酶具有同源關系,結構上非常相似,且在一定條件下血藍蛋白又具有酚氧化酶活性。本研究主要通過構建擬穴青蟹的c DNA文庫,借助c DNA末端快速擴增(RACE)技術和實時熒光定量PCR技術對擬穴青蟹酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的兩個相關基因以及血藍蛋白基因進行了克隆和不同模式下的表達分析,并利用生物信息學的方法對獲得的序列進行了分析研究,試圖從分子生物學的角度來探討這些基因之間的關系以及它們在擬穴青蟹免疫過程中的作用,以期為緩解擬穴青蟹養(yǎng)殖業(yè)的病害問題提供重要的理論基礎。本文主要研究結果總結如下:1、酚氧化酶原激活酶(PPAF)是一類含有clip結構域的絲氨酸蛋白酶,可以激活無活性的酚氧化酶原(pro PO),從而引起病原菌的黑化反應,是酚氧化酶系統(tǒng)的關鍵組成部分。本文克隆到了擬穴青蟹PPAF1和PPAF2兩個基因的c DNA全長,比對結果顯示它們與其他物種的PPAF具有較高的同源性,綜合分析后分別命名為Sp PPAF1和Sp PPAF2。Sp PPAF1序列c DNA全長為1677bp,其中包括52bp的5’-末端非轉錄區(qū)(5’-UTR),1131bp的ORF和494bp的3’-末端非轉錄區(qū)(3’-UTR),共編碼376個氨基酸,預測蛋白分子量38.43 k Da。Sp PPAF2序列c DNA全長為1808bp,其中包括88bp的5’-UTR,1125bp的ORF和595bp的3’-UTR,共編碼374個氨基酸,預測蛋白分子量38.56 k Da。Sp PPAF1和Sp PPAF2都含有如下結構:信號肽區(qū)域、一個典型的N端clip結構域和具有催化活性的C端絲氨酸蛋白結構域。兩者氨基酸序列相似性為81.0%。熒光定量PCR實驗結果顯示Sp PPAF1和Sp PPAF2在7個組織(血液、肝胰腺、鰓、精巢、心臟、肌肉和卵巢)中均有表達,其中Sp PPAF1在鰓、精巢和血液中表達量較高,Sp PPAF2主要在血液中表達。用副溶血弧菌感染處理大眼幼體,結果顯示Sp PPAF1和Sp PPAF2的表達量除了感染的前6 h變化趨勢有略微不同外,在接下來的6 h都顯著升高,至12h時達到最大值,隨后下降,至72 h時基本恢復正常水平。結果表明擬穴青蟹中PPAF可能與機體對外來病原的免疫防御作用密切相關,作用周期大約為72 h。2、酚氧化酶原(pro PO)是一種含銅的保守酶,也是酚氧化酶原激活系統(tǒng)的關鍵組成部分和黑色素生成的關鍵酶。本文獲得了擬穴青蟹pro PO基因的c DNA全長,比對結果顯示它與其他物種的pro PO具有較高的同源性,經綜合分析后確定命名為Sppro PO。該序列全長為2688bp,其中包括40bp的5’-UTR,2133bp的ORF和515bp的3’-UTR,共編碼710個氨基酸,預測蛋白分子量約為81.5 k Da,等電點約為6.01。序列分析結果顯示Sppro PO含有三個串聯(lián)的血藍蛋白保守結構域和兩個保守的銅離子結合位點。運用熒光定量PCR技術檢測了Sppro PO在擬穴青蟹不同組織中的表達差異情況,結果顯示Sppro PO在擬穴青蟹的7個不同組織中均有表達,其中在血液和精巢中表達量較高,在心臟中的表達量最低。本實驗為深入研究擬穴青蟹酚氧化酶原基因的結構和功能奠定了基礎。3、血藍蛋白(Hc)是許多節(jié)肢動物和軟體動物中重要的呼吸蛋白,為動物的生存提供了重要的支撐。本文克隆到了擬穴青蟹中Hc1、Hc2、Hc3和Hc4四個基因的c DNA全長,比對結果顯示它與其他物種的Hc具有較高的同源性,綜合分析后分別命名為Sp Hc1、Sp Hc2、Sp Hc3和Sp Hc4,全長分別為2281 bp,2002 bp,2184 bp和2069 bp,分別編碼676,570,672和671個氨基酸,預測蛋白分子量分別為76.8,65.0,76.3和76.4 k Da。序列分析結果顯示Sp Hc含有三個串聯(lián)的血藍蛋白保守結構域和兩個保守的銅離子結合位點。運用熒光定量PCR技術研究了血藍蛋白基因在擬穴青蟹各個不同組織,n炞從滋錤1-Z5期、大眼幼體M期以及仔蟹C1期等7個不同發(fā)育階段的時空表達差異。分析結果表明Sp Hc在各個組織中均有表達,其中主要在肝胰腺、精巢和血液中表達;另外,在不同的發(fā)育時期也均有表達,其中在前6個發(fā)育時期時,Sp Hc3和Sp Hc4的表達量要顯著高于Sp Hc1和Sp Hc2,但到仔蟹期時Sp Hc3和Sp Hc4的表達量突然下降,低于Sp Hc1和Sp Hc2。副溶血弧菌感染試驗結果表明:在感染后的前3 h內,Sp Hc的表達量明顯下降,在隨后的9 h逐漸上升,至12 h時達到最大值。研究結果說明血藍蛋白基因可能參與了擬穴青蟹的免疫抗菌過程,且四個血藍蛋白基因在擬穴青蟹不同發(fā)育時期可能發(fā)揮著不同的作用,Sp Hc3和Sp Hc4可能在青蟹浮游生活時期發(fā)揮主要作用,而Sp Hc1和Sp Hc2可能在其底棲及以后的生活中發(fā)揮主要作用。綜上所述,本研究共克隆得到了7個與擬穴青蟹酚氧化酶系統(tǒng)相關的基因的c DNA全長序列,并研究了他們在擬穴青蟹中不同模式下的表達差異情況。研究結果初步揭示了擬穴青蟹酚氧化酶系統(tǒng)及血藍蛋白的分子基礎以及應對微生物感染的調控趨勢,為今后這些基因的功能研究奠定了基礎。
【圖文】：

圖 1-1 甲殼動物酚氧化酶原激活系統(tǒng)簡圖[9]Fig. 1-1 Schematic view of crustacean prophenoloxidase activating system[9].2 酚氧化酶原激活系統(tǒng)關鍵基因的研究概況

圖 2-1 擬穴青蟹總 RNA 電泳圖trophoresis profiles of S. paramamo SpPPAF2 基因全長 cDNA 的接驗證，本實驗獲得擬穴青蟹現(xiàn)它們與其他物種的 PPAF 具成員，經綜合分析后分別命名據(jù)庫，GenBank 登錄號分別為 bp 的堿基組成，其中包括 52TR，共編碼376個氨基酸，預測核苷酸以及對應的氨基酸序列基組成，其中包括 88bp 的 5編碼 374 個氨基酸，預測蛋白兩條序列都含有多聚腺苷酸過 SignalP 軟件預測發(fā)現(xiàn)，，兩此預測 SpPPAF1 成熟肽包含
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 嚴芳;章躍陵;羅活強;胡忠;黃通旺;葉向群;;凡納濱對蝦血藍蛋白酚氧化酶活性的研究[J];水產科學;2008年01期

相關博士學位論文 前1條

1 嚴芳;甲殼動物血藍蛋白免疫學活性及其作用機制研究[D];汕頭大學;2011年

本文編號：2663529