【摘要】：本研究以我國鲆鰈類主導(dǎo)養(yǎng)殖品種—半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)為研究對象,針對養(yǎng)殖魚無眼側(cè)黑化的表觀現(xiàn)象,運(yùn)用顯微觀察技術(shù),研究了其皮膚黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞及鱗片的形態(tài)特征,探明了其數(shù)量分布與體色的關(guān)系;利用分子克隆技術(shù)克隆了黑化相關(guān)功能基因POMC,p MCH,MCHR,分析了其基因結(jié)構(gòu)和多態(tài)特性,探究了它們在各個組織中的表達(dá)情況;采用實(shí)時熒光定量PCR方法研究了POMC,p MCH,MCHR在不同黑化程度實(shí)驗(yàn)魚的腦垂體和皮膚中的表達(dá)變化規(guī)律,分析了體色相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控與無眼側(cè)黑化程度的關(guān)系。研究結(jié)果可為半滑舌鰨無眼側(cè)黑化的細(xì)胞與分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:1.半滑舌鰨體表色素細(xì)胞形態(tài)、鱗片特征與黑化的關(guān)系半滑舌鰨色素細(xì)胞類型主要有3種:黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞。黑色素細(xì)胞較大,細(xì)胞直徑10-60μm,細(xì)胞形狀不規(guī)則,大體分為兩種類型:一種樹突狀分枝不明顯;另一種延伸成放射狀。黃色素細(xì)胞較小,圓形或橢圓形,細(xì)胞直徑1-5μm,視野下呈黃色。虹彩細(xì)胞較大,細(xì)胞直徑10-70μm,分布較均勻,形狀不規(guī)則,呈卵圓形、棒狀或多邊形等。半滑舌鰨無眼側(cè)正常皮膚中未發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞分布,而無眼側(cè)黑化皮膚黑色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞的分布數(shù)量顯著低于有眼側(cè)正常皮膚(P0.05)。無眼側(cè)正常皮膚中黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞數(shù)量與有眼側(cè)正常皮膚和無眼側(cè)黑化皮膚相比也較少。半滑舌鰨色素細(xì)胞主要在皮膚上分布(約占70%)。在無眼側(cè)黑化的皮膚上,以延伸成放射狀的黑色素細(xì)胞分布為主(占60%以上),而在有眼側(cè)正常皮膚上,以樹突狀分枝不明顯的黑色素細(xì)胞分布為主;在無眼側(cè)黑化和有眼側(cè)正常鱗片上,都是以的分枝不明顯的黑色素細(xì)胞為主,且鱗片上的黑色素細(xì)胞分布相對稀疏。生活史中,半滑舌鰨無眼側(cè)鱗片類型經(jīng)歷了櫛鱗→弱櫛鱗→圓鱗逐漸轉(zhuǎn)變的過程,但無眼側(cè)黑化區(qū)域的鱗片仍為櫛鱗,在無眼側(cè)黑化與正常皮膚交界處發(fā)現(xiàn)了弱櫛鱗。無眼側(cè)黑化魚的體表兩側(cè)櫛鱗的類型與形態(tài)特征相似,但有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚和無眼側(cè)正常皮膚的鱗片上硬棘數(shù)量不同,提示半滑舌鰨無眼側(cè)黑化發(fā)生過程中鱗片形態(tài)及其調(diào)控機(jī)制也發(fā)生了明顯變化。2.半滑舌鰨阿黑皮素原(POMC)的克隆和表達(dá)特性分析首次從半滑舌鰨垂體中獲得了兩種POMC亞型-POMC-a和POMC-b c DNA全長序列,全長分別為910bp和844bp,開放閱讀框(ORF)分別為642bp和537bp,5’非編碼區(qū)分別為113bp和87bp,3’非編碼區(qū)分別為154bp和210bp。POMC-a和POMC-b分別編碼213和178個氨基酸,除信號肽區(qū)域外,其序列均編碼促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),α-黑色素刺激素(α-MSH),β-黑色素刺激素(β-MSH),γ-促脂素(γ-LPH),β-內(nèi)啡肽,但缺失了γ-黑色素刺激素(γ-MSH)和大部分連接區(qū)域。POMC-a和POMC-b預(yù)測蛋白分子量分別為23.7KDa和19.5KDa,預(yù)測等電點(diǎn)分別為6.51和6.91。同源性分析顯示,半滑舌鰨POMC-a的氨基酸序列與鰈形目、鱸形目的同源性為61.2%-66.5%,與黃鰭鯛的同源性最高;POMC-b的氨基酸序列與鰈形目、鱸形目的同源性達(dá)到51.8%-61.2%,與歐鰨的同源性最高。半滑舌鰨POMC-a和POMC-b具有不同的組織表達(dá)特性,其中POMC-a m RNA主要在垂體表達(dá),在腦、腸、有眼側(cè)皮膚和無眼側(cè)黑化皮膚中也有少量表達(dá);POMC-b m RNA主要在垂體中表達(dá),在腦、脾臟、肝臟和頭腎中有少量表達(dá)。無眼側(cè)黑化皮膚中POMC-a和POMC-b m RNA表達(dá)水平均顯著高于有眼側(cè)皮膚和無眼側(cè)正常皮膚。腦垂體和皮膚中POMC的表達(dá)與無眼側(cè)黑化程度密切相關(guān),其中腦垂體POMC-a m RNA表達(dá)在無眼側(cè)50%黑化組達(dá)最高,皮膚POMC-a m RNA表達(dá)在10%黑化組最高,其后隨黑化程度增加而顯著降低。腦垂體POMC-b m RNA表達(dá)水平也在50%黑化組達(dá)峰值,皮膚POMC-b m RNA表達(dá)水平在10%黑化組最高,其后顯著下降。3.半滑舌鰨黑色素富集激素(MCH)的克隆和表達(dá)特性首次從半滑舌鰨腦中獲得了p MCH2 c DNA全長序列,全長626bp,ORF長為444bp,5’端非編碼區(qū)長32bp,3’端非編碼區(qū)長150bp,共編碼147個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為16.2KDa,預(yù)測等電點(diǎn)為5.80。MCH2核心肽位于p MCH2序列379-441bp處,編碼21個氨基酸。p MCH1 c DNA部分序列ORF長405bp,編碼134個氨基酸。MCH1位于p MCH1序列352-402bp處,編碼17個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為14.8KDa,預(yù)測等電點(diǎn)為6.22。同源性分析表明,半滑舌鰨MCH1、MCH2氨基酸序列都表現(xiàn)出與鰈形目魚類最高的同源性(56%-66.9%)。半滑舌鰨p MCH m RNA主要在垂體中表達(dá)。此外,p MCH1在有眼側(cè)皮膚、腸、性腺和腦中有少量表達(dá),p MCH2在有眼側(cè)皮膚、性腺、腦、無眼側(cè)正常皮膚和鰓中有少量表達(dá)。皮膚中p MCH1和p MCH2 m RNA具有相反的表達(dá)趨勢,無眼側(cè)黑化皮膚中p MCH1 m RNA表達(dá)顯著高于無眼側(cè)正常皮膚,而p MCH2 m RNA表達(dá)則顯著低。不同黑化程度表達(dá)中,MCH1 m RNA在腦垂體和皮膚中表現(xiàn)出類似的表達(dá)變化趨勢,都在10%黑化組表達(dá)量達(dá)峰值,而后隨著黑化程度的加大顯著降低;MCH2在皮膚中則表現(xiàn)出隨黑化程度加大而表達(dá)顯著增強(qiáng)的趨勢,表明MCH在腦垂體和皮膚層面參與了無眼側(cè)黑化性狀發(fā)生與發(fā)展的調(diào)控過程。4.半滑舌鰨黑色素富集激素受體(MCHR)的克隆和表達(dá)特性首次從半滑舌鰨腦中獲得了MCHR1和MCHR2 c DNA全長序列,c DNA全長分別為1685bp和1626bp,ORF長分別為1080bp和1044bp,5’非編碼區(qū)分別長262bp和213bp,3’非編碼區(qū)分別為343bp和369bp。MCHR1和MCHR2分別編碼359和347個氨基酸,都包括7個跨膜結(jié)構(gòu)域。此外,在3’端末端都含有一個加尾信號AATAA。其預(yù)測蛋白分子量分別為23.7KDa和19.5KDa,預(yù)測等電點(diǎn)分別為6.51和6.91。半滑舌鰨MCHR的氨基酸序列與鰈形目魚類的同源性最高(81.8-91.6%)。組織表達(dá)分析顯示,半滑舌鰨MCHR1 m RNA主要在鰓中表達(dá),在脾、性腺和有眼側(cè)皮膚中有少量表達(dá),MCHR2 m RNA主要在有眼側(cè)皮膚中表達(dá),在性腺中有少量表達(dá)。MCHR在無眼側(cè)黑化皮膚中的表達(dá)量與無眼側(cè)正常皮膚、有眼側(cè)皮膚差異表達(dá)顯著。時空表達(dá)分析顯示,無眼側(cè)黑化發(fā)生早期MCHR1 m RNA顯著升高,在無眼側(cè)50%黑化組達(dá)峰值,皮膚中MCHR1 m RNA在無眼側(cè)10%黑化組顯著升高,其后保持較高水平;腦垂體和皮膚中MCHR2 m RNA表達(dá)表現(xiàn)出一致的變化趨勢,在無眼側(cè)黑化發(fā)生早期MCHR2 m RNA都達(dá)到峰值其后逐漸下降至相對較低水平。表明MCHR可能直接或通過其它信號通路參與了半滑舌鰨無眼側(cè)黑化性狀的調(diào)控過程。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

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本文編號：2662552