【摘要】：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種,它主要由半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)執(zhí)行,這類半胱氨酸蛋白酶被稱為Caspase。細(xì)胞凋亡在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持,組織與器官發(fā)育以及免疫防御等方面都發(fā)揮著重要作用。目前在高等生物中,Caspase家族蛋白及其介導(dǎo)的凋亡調(diào)控通路已研究得較為透徹,而對無脊椎動(dòng)物,尤其是軟體動(dòng)物的研究還十分有限。本研究以長牡蠣(Crassostrea gigas)為研究對象,利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生物信息學(xué)等相關(guān)技術(shù)手段,對長牡蠣Caspase-3(命名為CgCaspase-3)、Caspase-8(命名為CgCaspase-8)的功能及其介導(dǎo)的凋亡調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。CgCaspase-3基因的開放閱讀框(ORF)為924 bp,編碼307個(gè)氨基酸,CgCaspase-8基因ORF全長為1455bp,編碼484個(gè)氨基酸。CgCaspase-3和CgCaspase-8分子皆為酶原形式,包含典型的CASc結(jié)構(gòu)域及酶活性位點(diǎn)。CgCaspase-3和CgCaspase-8 mRNA在各組織中皆呈組成性表達(dá),且都在外套膜及血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量較高,性腺中較低。在長牡蠣個(gè)體發(fā)育各個(gè)階段(2細(xì)胞期-殼頂期),CgCaspase-3和CgCaspase-8 mRNA皆有表達(dá),但表達(dá)模式不同。細(xì)胞內(nèi)定位顯示,Cg Caspase-3分子少量分布于細(xì)胞核中,而CgCaspase-8分子僅分布于細(xì)胞質(zhì)中。CgCaspase-3酶原形式已具有催化活性,傾向于Asp-Xaa-Xaa-Asp(DXXD)形式底物。而Caspase-3特異性抑制劑Ac-DEVD-CHO及Caspase家族蛋白酶泛抑制劑Z-VAD-FMK都對rCgCaspase-3酶活性有顯著的抑制效果。胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣表明CgCaspase-3可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外,CgCaspase-3具有模式識別受體(PRR)的功能,LPS親和層析、基于ELISA原理的LPS結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及胞內(nèi)共定位檢測都表明CgCaspase-3可以直接結(jié)合LPS,而表面等離子共振(SPR)檢測發(fā)現(xiàn)與LPS結(jié)合具有高度特異性,其解離常數(shù)(KD)為1.08×10-6 M,未檢測到CgCaspase-3與磷壁酸、甘露聚糖及葡聚糖的結(jié)合活性。CgCaspase-3截短體重組蛋白rCgCas-3(NT)及rCgCas-3(ΔN58)與LPS結(jié)合能力均顯著降低。體外檢測環(huán)境下,LPS可以抑制rCgCaspase-3的活性,且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。而胞內(nèi)LPS同樣可以抑制CgCaspase-3對底物(PARP)的水解活性,抑制細(xì)胞凋亡。CgCaspase-8分子對Caspase-8的底物(Ac-IETD-pNA)水解活性微弱,激活后,其活性有一定程度提高,并且rCgCaspase-3可在rCgCaspase-8作用下發(fā)生水解,形成約20 kDa和11 kDa小片段。CgCaspase-8可抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其Caspase-8特異性抑制劑Z-IETD-FMK對CgCaspase-8酶活性具有顯著抑制作用。胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染CgCaspase-3與CgCaspase-8實(shí)驗(yàn)表明,CgCaspase-3與CgCaspase-8完全共定位,兩者可能存在相互作用。CgCaspase-8能夠響應(yīng)LPS、PGN及燦爛弧菌刺激,其中對LPS和燦爛弧菌刺激響應(yīng)強(qiáng)烈。LPS刺激后,CgCaspase-8 mRNA及蛋白表達(dá)水平皆顯著上升,后逐漸下降。而燦爛弧菌刺激,CgCaspase-8 mRNA表達(dá)量同樣在3 h達(dá)到峰值,其后下降,而蛋白表達(dá)量則從0 h后逐漸降低,mRNA表達(dá)水平變化與蛋白水平不同。上述研究結(jié)果表明,與脊椎動(dòng)物相比,長牡蠣Caspase家族成員Cg Caspase-3和CgCaspase-8分子在進(jìn)化上高度保守,具有典型的CASc結(jié)構(gòu)域及半胱氨酸水解酶活性,皆可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并可響應(yīng)不同的免疫刺激。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)長牡蠣存在特殊的凋亡調(diào)控機(jī)制,LPS可以抑制CgCaspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,這在其他高等生物及無脊椎生物中從未報(bào)道。這種特殊的調(diào)控機(jī)制可能在長牡蠣免疫防御中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果為深入研究無脊椎動(dòng)物Caspase家族蛋白功能及凋亡調(diào)控機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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