【摘要】：脯氨酰內(nèi)肽酶(Prolyl endopeptidase/PEP/PREP)隸屬于絲氨酸蛋白酶家族,在醫(yī)學,食品科學中有較大應用潛力。本研究選用皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai),克隆得到皺紋盤鮑脯氨酰內(nèi)肽酶的cDNA序列并進行體外表達,同時對其性質(zhì)進行了相關研究。通過對多個物種的PEP基因中的保守序列進行分析后設計特異性引物,采用巢式PCR和RACE技術從皺紋盤鮑的肝胰腺組織中克隆獲得了脯氨酰內(nèi)肽酶(Hdh-PEP)基因的cDNA全長序列。序列分析結(jié)果顯示Hdh-PEP的cDNA全長共3224個堿基對(bp),包含5’端非編碼區(qū)序列51 bp,3’端非編碼區(qū)1052 bp,開放閱讀框2121 bp,編碼706個氨基酸殘基。序列比對結(jié)果顯示,Hdh-PEP的氨基酸序列與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)、和人(Homo sapiens)PEP的序列相似度分別為70%、65%和63%。經(jīng)預測,Hdh-PEP基因編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為80.3 ku,理論等電點為5.55,屬于相對穩(wěn)定的親水蛋白。Hdh-PEP的二級結(jié)構與三級結(jié)構模擬分析顯示其具有典型的PEP家族特征,有“α-催化結(jié)構域”和“β-螺旋槳結(jié)構域”兩部分形成的“匣式”結(jié)構。系統(tǒng)發(fā)育關系分析結(jié)果表明Hdh-PEP在腹足綱PEP中形成了獨立的進化分支。通過將編碼Hdh-PEP的全長序列連接至pET-28a載體上,構建了原核重組表達載體pET-28a-HP。表達并純化了具有酶活性的重組Hdh-PEP。重組Hdh-PEP的理論相對分子量為85.4 ku,包含了原Hdh-PEP 80.3 ku以及載體自帶的組氨酸標簽等序列4.1 ku,與SDS-PAGE結(jié)果相符。對純化產(chǎn)物進行肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜分析獲得結(jié)果與分子克隆結(jié)果相比較,氨基酸序列100%相符,證明重組表達得到的蛋白為Hdh-PEP。酶學性質(zhì)分析表明,Hdh-PEP的最適溫度和最適pH分別為20℃和6.0,且在低溫范圍內(nèi)(10℃-20℃)和pH 6.0-9.0時能保持相對較高的酶活力,在溫度高于30℃時即失活。Hdh-PEP能夠特異分解羧基端含有脯氨酸殘基的熒光底物Suc-Gly-Pro-MCA和Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA,在最適環(huán)境下進行分解時的比活力為6.57 U/μg。選取了多種抑制劑及金屬離子對Hdh-PEP進行了抑制作用分析,結(jié)果顯示,特異性抑制劑SUAM-14746能夠強烈抑制Hdh-PEP的活性,Na~+和Mg~(2+)對Hdh-PEP的活性沒有產(chǎn)生顯著影響。Ca~(2+)對Hdh-PEP的活性可起到少許促進作用。合成小肽EGAR和水飛薊賓(Silibinin)對Hdh-PEP的抑制效果相對較弱。SUAM-14746對Hdh-PEP表現(xiàn)為競爭性抑制作用,Cu~(2+)對Hdh-PEP的抑制類型為混合型抑制。Zn~(2+)和Al~(3+)在抑制Hdh-PEP活性時會對其二級結(jié)構產(chǎn)生影響,而Cu~(2+),Pb~(2+)和Ag~+抑制Hdh-PEP活性時不會對其二級結(jié)構產(chǎn)生明顯影響。使用Western Blot技術檢測Hdh-PEP在皺紋盤鮑各組織中的表達量。結(jié)果顯示,實驗所用的兔抗羅非魚PEP多克隆抗體對天然Hdh-PEP和重組Hdh-PEP均有特異性的免疫雜交反應。Hdh-PEP在皺紋盤鮑血細胞中的表達量較高,鰓中次之。但未能在腹足肌肉中檢測到Hdh-PEP的表達。通過對Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品化PEP儲存液配方進行改良,改良后的儲存緩沖液可在75天內(nèi)將Hdh-PEP的活性保持在90%以上。本研究對皺紋盤鮑PEP的分子克隆豐富了貝類PEP的研究內(nèi)容并建立了穩(wěn)定的表達體系。為貝類PEP的后續(xù)研究提供了一定的理論基礎。
【學位授予單位】：集美大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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本文編號：2662026