【摘要】：近些年,伴隨著抗生素的大量生產(chǎn)和使用,細(xì)菌耐藥性已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在多種環(huán)境介質(zhì)如土壤、水體、水生生物中存在耐藥細(xì)菌�？耸显椢r生活在淡水水體如湖泊、河流等環(huán)境內(nèi),這些環(huán)境中細(xì)菌種類豐富,細(xì)菌的耐藥基因呈多樣性,不同種屬的細(xì)菌之間可以通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)原件進(jìn)行耐藥基因交換,并將耐藥基因擴(kuò)散、傳播給其他物種�，F(xiàn)階段,我國(guó)對(duì)水產(chǎn)細(xì)菌耐藥性研究及監(jiān)測(cè)遠(yuǎn)沒(méi)有對(duì)人和畜禽細(xì)菌耐藥性研究的深入和系統(tǒng)。為研究我國(guó)克氏原鰲蝦源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥水平,獲得耐藥本底數(shù)據(jù),闡明耐藥基因擴(kuò)散和水平傳播機(jī)制,本研究采集來(lái)自山東、湖北、浙江、江蘇、遼寧五省共198份克氏原鰲蝦活體樣品,通過(guò)頭孢噻肟抗性(8μg/m L)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、PCR方法和BD PhoenixTM-100 system全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)分離、鑒定產(chǎn)ESBLs大腸桿菌;然后通過(guò)全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)、雙紙片協(xié)同作用對(duì)其藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè);根據(jù)藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果,使用多重PCR等方法篩選β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因、質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因(PMQR)和16s r RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶等耐藥基因;通過(guò)接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)來(lái)確定耐藥基因擴(kuò)散、傳播水平及機(jī)制。結(jié)果顯示:從來(lái)自山東、湖北、浙江、江蘇、遼寧五個(gè)省份共計(jì)198份克氏原鰲蝦活體樣品中分離鑒定出107株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌,ESBLs陽(yáng)性分離率為54.0%;所有樣品分離株對(duì)青霉素類、一代頭孢菌素和部分三代頭孢菌素均耐藥;對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素類和磺胺類藥物耐藥率均在60%以上(65株);對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥率較低;多重耐藥菌株(R≥3類藥物)占比例為86.7%(96/107),且以5類(30%,31/107)和6類(28%,30/107)耐藥為主。對(duì)107株蝦源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌樣品進(jìn)行耐藥基因鑒定,結(jié)果表明它們均攜帶bla CTX-M基因,其中以bla CTX-M-1群基因(74%,78/107)最普遍,其次是bla CTX-M-9群基因(20%,21/107)、bla CTX-M-2群基因(7.48%,8/107),只有一株分離菌株同時(shí)攜帶bla CTX-M-1群基因和bla CTX-M-9群基因;而bla Amp C類基因陽(yáng)性菌株共9株(8.4%),其中以bla CMY-2亞型為優(yōu)勢(shì)型(87.5%,7/8),其次為bla CMY-42型,這是首次在我國(guó)動(dòng)物源食品ESBLs大腸桿菌中檢測(cè)到bla CMY-42型基因,另外一株為bla DHA-1陽(yáng)性(0.9%),其他基因如bla MOX、bla ACC、bla EBC、bla FOX和bla SHV均未檢出。此外,在樣品分離株中檢測(cè)到54株攜帶bla TEM基因(50.5%),且均為非ESBLs型的bla TEM-1亞型�？傮w來(lái)說(shuō),五省均保持一致性,以bla CTX-M-1群基因?yàn)橹�。在檢測(cè)107株產(chǎn)ESBLs樣品大腸桿菌攜帶可移動(dòng)、非β-內(nèi)酰胺類耐藥基因時(shí)發(fā)現(xiàn),攜帶qnr S基因的菌株有38株,檢出率為35.5%(38/107),以qnr S1型和qnr S2型為主,其次是攜帶oqx A基因(33.6%,36/107),攜帶oqx B基因(32.7%,35/107)和攜帶aac(6’)-Ⅰb-cr基因(18.7%,20/107),qep A基因的陽(yáng)性檢出率僅為1.87%(2/107);在PMQR組合中,oqx A+oqx B基因組合最常見(jiàn)(31.8%,34/107),同時(shí)攜帶2種以上喹諾酮基因的菌株有37株,是主要的耐喹諾酮類藥物的機(jī)制。對(duì)16s r RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行檢測(cè)后,發(fā)現(xiàn)部分arm A基因(0.93%,1/107)和rmt B基因(11.2%,12/107)陽(yáng)性菌株,其中rmt B基因陽(yáng)性株主要分布在山東省和江蘇省,在遼寧省有一株同時(shí)攜帶arm A基因和rmt B基因的樣品株。對(duì)107株蝦源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的可移動(dòng)原件進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)到11種質(zhì)粒型,以Inc FIIA質(zhì)粒(52.3%,56/107)為主要類型,而且以同時(shí)攜帶兩種質(zhì)粒型為主(31.8%,34/107);同時(shí),有77株攜帶Ⅰ型整合酶基因(72.0%,77/107),僅1株攜帶Ⅱ型整合酶基因(0.9%)。Ⅰ型整合酶陽(yáng)性樣品分離菌株中有34株可變區(qū)域內(nèi)沒(méi)有攜帶外源基因,43株(55.8%,43/77)可變區(qū)內(nèi)攜帶耐藥基因,以dfr A17-aad A5基因盒為主(32.6%,14/43),Ⅱ型整合酶陽(yáng)性分離菌株攜帶drf A12-sat2-aad A1的基因盒。隨機(jī)挑選57株攜帶bla CTX-M基因的分離菌株作為供體菌,以E.coli J53為受體菌,進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有43株接合轉(zhuǎn)移成功,接合轉(zhuǎn)移發(fā)生率為75.4%(43/57),且接合子均攜帶bla CTX-M基因。而且大部分PMQR基因也都同時(shí)轉(zhuǎn)移到了接合子中;另外,在部分接合子中還檢測(cè)到16s r RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、整合酶基因,說(shuō)明這些基因可能都位于接合性質(zhì)粒上,并且隨著質(zhì)粒與其他耐藥基因共同轉(zhuǎn)移、傳播和擴(kuò)散。本研究對(duì)采自山東、江蘇、浙江、湖北和遼寧五個(gè)省份的克氏原鰲蝦腸道內(nèi)ESBLs大腸桿菌進(jìn)行了分離鑒定、耐藥基因篩選、可移動(dòng)原件篩選及和接合轉(zhuǎn)移等實(shí)驗(yàn),獲得了五個(gè)省份耐藥大腸桿菌的流行病學(xué)本底,為克氏原螯蝦細(xì)菌耐藥性防控和水產(chǎn)品公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ),也為水產(chǎn)食品安全檢測(cè)提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 3.1 大腸桿菌 16s rDNA 特異性 PCR 鑒定結(jié)果Fig. 3.1 The results of 16s rDNA specific identification to E.coli和 2：樣品分離株；3：陽(yáng)性對(duì)照；4：陰性對(duì)照；M：Marker DL2and 2, Isolates; 3, Positive control; 4, Negative control; M, Marker DL2

圖 3.2 ESBLs 表型確認(rèn)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性Positive result of phenotypic confirmatory test for ESBLs 腸桿菌的藥敏鑒定考 CLSI 耐藥標(biāo)準(zhǔn)對(duì) 107 株蝦源產(chǎn) ESBLs 大腸
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S941.4

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本文編號(hào)：2654573