【摘要】：溶菌酶是動植物界中廣泛存在的一種天然活性物質(zhì),因其獨特的抗菌和調(diào)理功能而被應用于動物生產(chǎn)、食品防腐以及醫(yī)藥制劑等諸多領域。其中,溶菌酶作為一種新型綠色的飼料添加劑在畜禽動物上的研究已久,但在水產(chǎn)動物上的應用研究仍較為薄弱,僅見于異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)和草魚(Ctenopharyngodon idellus)。在現(xiàn)有的研究結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶的作用效果并不完全一致,可能在于魚的種屬和消化道內(nèi)環(huán)境不同,使溶菌酶進入魚體內(nèi)后的活性發(fā)揮和吸收利用存在差異性,最終導致其利用效果的不同。為此,我們選用吉富羅非魚(GIFT,Oreochromis niloticus)為本次研究對象,開展溶菌酶作用效果和吸收利用機制的研究,為提高飼用溶菌酶的利用率及其在水產(chǎn)飼料中的合理應用提供參考。內(nèi)容主要包括六章:第一章通過研究在飼料中添加溶菌酶后對吉富羅非魚生長、免疫 抗氧化能力和血清抗菌性能的影響,綜合評估在正常養(yǎng)殖條件下溶菌酶在吉富羅非魚飼料中的最適添加量;第二章設計氨氮應激試驗,從血清生化、抗菌性能和肝臟抗氧化能力方面評估不同溶菌酶添加水平對吉富羅非魚抗氨氮應激能力的影響,為溶菌酶在應激條件下的使用提供參考劑量;第三章從消化生理方面探究不同溶菌酶添加水平對吉富羅非魚消化道組織結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響,深入解析溶菌酶與羅非魚生長之間的內(nèi)在關系;第四章探究外源性溶菌酶的添加對吉富羅非魚內(nèi)源c型溶菌酶和NF κB基因表達的影響,以期從分子水平尋找外源溶菌酶與內(nèi)源免疫基因和其調(diào)控通路中關鍵基因之間的相互聯(lián)系,解析溶菌酶的添加對吉富羅非魚免疫機能的影響;第五章根據(jù)前期研究結(jié)果設計四個溶菌酶添加水平下的胃排空試驗,根據(jù)胃排空時間和消化道(包括內(nèi)容物)內(nèi)環(huán)境的變化探究添加不同水平的溶菌酶對羅非魚消化生理上的影響規(guī)律;第六章采用體內(nèi)外試驗結(jié)合法,通過測定飼用溶菌酶對羅非魚肝臟和胃腸道各部位的耐受性以及運用FITC lysozyme體內(nèi)示蹤技術來探索溶菌酶在魚體內(nèi)主要部位的吸收代謝規(guī)律,從而得出其在吉富羅非魚體內(nèi)的適宜作用部位和功效發(fā)揮時間。試驗一:飼料中添加溶菌酶對吉富羅非魚生長、免疫 抗氧化功能及血清抗菌性能的影響為探究正常養(yǎng)殖條件下溶菌酶在吉富羅非魚(11.35±0.08)g飼料中的最適添加量,設置6個溶菌酶添加水平的試驗飼料,分別在基礎組飼料中添加0(l0)、18(l18)、36(l36)、54(l54)、72(l72)和90(l90)mg/kg的溶菌酶制品(5×103u/mg),在室外水泥池中的等大尼龍網(wǎng)箱中飼喂吉富羅非魚60d,考察不同溶菌酶添加水平對吉富羅非魚生長、免疫 抗氧化能力和血清抗菌性能的影響。結(jié)果表明:(1)54mg/kg溶菌酶添加組魚的生長性能和飼料利用情況最優(yōu),增重率和蛋白質(zhì)效率均顯著高于對照組,飼料系數(shù)顯著低于對照組(p0.05);肝體比隨溶菌酶添加水平的增加呈現(xiàn)下降趨勢,90mg/kg添加組顯著低于對照組(p0.05);脾臟指數(shù)在36和54mg/kg添加組顯著低于對照組(p0.05);全魚粗蛋白和粗灰分含量在54mg/kg添加組均呈現(xiàn)較高水平,顯著高于對照組(p0.05)。(2)溶菌酶添加水平對羅非魚的免疫 抗氧化能力產(chǎn)生影響,54和72mg/kg添加水平能顯著提高魚體血清和肝臟的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性,降低丙二醛含量(p0.05);肝臟溶菌酶活性在54和72mg/kg添加組均顯著高于對照組(p0.05),而血清溶菌酶活性隨溶菌酶添加水平的增加呈現(xiàn)下降趨勢(l90組除外),顯著低于對照組(p0.05)。(3)血清抗菌試驗顯示,54和72mg/kg溶菌酶添加組羅非魚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌和溶藻弧菌的抑制能力顯著高于對照組(p0.05),而對枯草芽孢桿菌的抵抗能力最低,比對照組分別低34.71%和42.21%(p0.05)。綜上所述,在吉富羅非魚飼料中添加54mg/kg溶菌酶制品可改善其生長性能;當添加水平為54和72mg/kg時,羅非魚的免疫-抗氧化能力和血清抗菌性能均得到了顯著提高。本試驗條件下,適宜添加量為54和72mg/kg。試驗二:飼料溶菌酶添加水平對氨氮應激下吉富羅非魚血清生化指標、抗菌性能和肝臟抗氧化能力的影響為探究溶菌酶對吉富羅非魚抗氨氮應激能力的影響并確定非正常情況下的適宜添加量,本試驗以養(yǎng)殖試驗結(jié)束后的吉富羅非魚(83.74±3.02)g為研究對象,以氯化銨為應激源,并調(diào)整水體總氨氮(t an)的表觀濃度為50mg/l,進行24h急性氨氮脅迫,通過比較各組魚的血清生化指標、抗菌活性和肝臟抗氧化指標來綜合判斷其抗氨氮應激能力并由此確定溶菌酶在特定條件的適宜添加量。結(jié)果表明:(1)應激后,各組魚的血清生化指標在組間存在較大差異(p0.05),不同溶菌酶添加水平下的魚體對氨氮應激產(chǎn)生了不同的響應機制。l54組魚主要通過激發(fā)免疫系統(tǒng)并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝來抵抗氨氮濃度突變;l72和l90組魚主要通過調(diào)節(jié)高密度脂蛋白和低密度脂蛋白、膽固醇和甘油三酯之間的動態(tài)變化來緩解氨氮對機體的應激。(2)血清抗菌試驗表明,l54和l72組魚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的抑制能力最大,且顯著高于對照組(p0.05);l36~l90組對溶藻弧菌的抑制作用顯著高于對照組和l18組(p0.05);各溶菌酶添加組的魚對枯草芽孢桿菌具有不同程度的保護作用。(3)應激后肝臟的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性隨溶菌酶添加水平的增加總體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢,l54組顯著高于對照組(p0.05);各添加組丙二醛含量均顯著低于對照組(p0.05)。綜上所述,54和72mg/kg溶菌酶添加水平對氨氮應激下吉富羅非魚的血清生化指標、抗菌活性和肝臟抗氧化指標產(chǎn)生了最積極有效的調(diào)控,能夠增強魚體的抗應激能力,此添加水平為氨氮應激條件下的適宜添加量。試驗三:飼料溶菌酶添加水平對吉富羅非魚消化道組織結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的影響在實驗一吉富羅非魚的飼養(yǎng)過程中,每15d收集糞便用于檢測各組魚對營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化吸收率,飼養(yǎng)60d后取消化道各組織檢測消化酶活性并做石蠟切片。結(jié)果顯示:(1)飼料中添加溶菌酶對吉富羅非魚肝臟和胃腸道消化酶活性產(chǎn)生了不同程度的影響(p0.05)。l36~l72組的胃、前腸和中腸蛋白酶活性顯著高于對照組(p0.05),而肝臟和后腸蛋白酶活性無組間差異(p0.05);l72或l90組的肝臟、胃和后腸淀粉酶活性顯著對照組(p0.05),前腸淀粉酶活性在l54組顯著高于對照組(p0.05),中腸淀粉酶活性在除l72組外的其余添加組均顯著高于對照組(p0.05);l54或l72組的脂肪酶活性顯著高于對照組(p0.05)。(2)腸道切片統(tǒng)計結(jié)果表明,l54和l72組的前腸和中腸絨毛密度、高度和寬度均顯著高于對照組(p0.05),肌層厚度與對照組無顯著性差異(p0.05);l36~l72組的后腸絨毛密度和高度顯著高于對照組(p0.05),絨毛寬度在溶菌酶添加組有升高趨勢,除l90組外均無顯著差異(p0.05),而肌層厚度在除l54組外的其余溶菌酶添加組有下降趨勢(p0.05);杯狀細胞數(shù)量在l54和l72組均顯著高于對照組(p0.05)。(3)肝臟切片圖顯示,l36和l54組魚肝細胞排列整齊,形狀飽滿,相較于對照組更加致密,但高劑量添加組的肝臟健康程度有下降趨勢。(4)消化吸收率方面,在養(yǎng)殖i(1~15d)和ii(16~30d)期內(nèi),l36~l90組對粗蛋白的消化吸收率顯著高于對照組(p0.05),但對粗脂肪的消化吸收率無組間差異性(p0.05);在養(yǎng)殖iii(31~45d)和iv(46~60d)期,l36~l90組在整體水平上對干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收率均顯著高于對照組(p0.05)。由此得出,本試驗條件下,在吉富羅非魚飼料中添加36~72mg/kg溶菌酶能提高消化酶活性并促進肝腸發(fā)育和健康;添加36~90mg/kg溶菌酶能不同程度地提高魚體對飼料干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪消化吸收率。。在實驗一吉富羅非魚飼養(yǎng)60d后取各組魚頭腎、脾臟、肝臟和腸道組織并運用rt pcr技術探索吉富羅非魚不同組織內(nèi)源c型溶菌酶和nf κb信號通路相關基因表達水平對外源性添加溶菌酶的響應。結(jié)果發(fā)現(xiàn):頭腎中,l54和l90組魚c1、c2、c3型溶菌酶和nf κb(p65)基因mrna表達量下調(diào)(p0.05);脾臟中,3種c型溶菌酶和nf κb(p65)mrna表達量均隨溶菌酶添加水平的提高而呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢,l54和l90組3種c型溶菌酶分別顯著高于或低于對照組(p0.05),nf κb(p65)mrna表達量在l18組顯著高于對照組和其余各組(p0.05);肝臟中,l18組的c1型溶菌酶和l54組的c2、c3型溶菌酶mrna表達量均顯著上調(diào)(p0.05),而nf κb(p65)基因的相對表達量在除l18組外均顯著低于對照組(p0.05);腸道中,l18和l54組的c2、c3型溶菌酶表達量均低于或顯著低于對照組(p0.05),nf κb(p65)mrna相對表達量隨溶菌酶添加水平的提高呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢,l18組顯著高于對照組(p0.05),l54和l90組顯著低于對照組(p0.05)。由此得出,添加18和54mg/kg的外源溶菌酶飼喂吉富羅非魚60d可分別提高肝臟和脾臟中nf κb(p65)和三種內(nèi)源c型溶菌酶的表達水平,而nf κb(p65)和溶菌酶基因在mrna表達水平上沒有直接相關性。試驗五:不同溶菌酶添加水平下吉富羅非魚的胃排空及消化道內(nèi)容物特性研究為考察吉富羅非魚攝食不同溶菌酶添加水平飼料的胃排空時間和在攝食消化過程中內(nèi)容物特性的變化規(guī)律,本試驗首先用溶菌酶添加水平分別為0(l0)、18(l18/低)、54(l54/中)和90(l90/高)mg/kg的飼料飼喂吉富羅非魚60d,然后采用fe2o3標記和連續(xù)取樣法對初始體重為(160±11.23)g的各組試驗魚進行胃排空試驗,通過分析胃內(nèi)容物總鐵含量的變化確定其胃排空時間,同時對比研究了各組魚攝食消化過程中內(nèi)容物水分、ph、營養(yǎng)成分含量以及內(nèi)容物和組織消化酶活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明:(1)指數(shù)模型和平方根模型均能較好地描述各組魚的胃排空曲線,但通過r2比較,l0和l18組更適合指數(shù)模型,l54和l90組更適合平方根模型。據(jù)各自的最優(yōu)模型分別計算l0、l18、l54和l90組魚胃50%排空時間依次為:7.97h、6.68h、6.74h、5.49h。(2)在24h的攝食消化過程中,溶菌酶添加組魚消化道各段內(nèi)容物的水分含量總體高于對照組(p0.05),同時有一個較快的上升速率(攝食后0~12h)和較長時間的峰期;l54和l90組魚胃內(nèi)容物ph值在攝食初期(0~6h)下降速率較快,食物到達腸道后仍能保持較低的ph值(p0.05),隨攝食時間的延長和食物的推移,l54組魚內(nèi)容物ph值能較快地恢復或接近初始水平;消化酶活性方面:l54和l90組魚胃組織和內(nèi)容物中消化酶比活力均顯著高于對照(p0.05),l54組前腸蛋白酶和脂肪酶活性在攝食0.5~6h均顯著高于對照組(p0.05),而組織淀粉酶活性無顯著性差異(p0.05);攝食0~12h內(nèi),l54和l90試驗四:外源性添加溶菌酶對吉富羅非魚不同組織內(nèi)源性c型溶菌酶及nf κb信號通路基因表達的影響組魚中腸內(nèi)容物的蛋白酶和淀粉酶比活力在整體水平上高于對照組(P0.05),各組內(nèi)容物脂肪酶比活力在整個攝食過程中均無顯著性差異(P0.05);L54組魚后腸內(nèi)容物蛋白酶活性在數(shù)值上高于其他組(P0.05),而淀粉酶和脂肪酶基本沒有太大差異。(3)營養(yǎng)成分方面:L54和L90組魚內(nèi)容物粗蛋白和粗灰分含量顯著高于對照組(P0.05),而粗脂肪含量顯著低于對照組(P0.05)。由此可見,飼料中添加54和90 mg/kg溶菌酶能夠縮短吉富羅非魚的胃排空時間,并通過加速水分吞飲、酸化食物以及提高消化酶活性和分泌量來提高機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用。試驗六:飼用溶菌酶在吉富羅非魚消化道的耐受性和吸收代謝規(guī)律體內(nèi)外研究為探究飼用溶菌酶在吉富羅非魚消化道和體內(nèi)的適宜作用和吸收部位并確定其藥效發(fā)揮時間,本試驗采用體外模擬實驗測定飼用溶菌酶對吉富羅非魚肝臟和胃腸道各部位的耐受性,運用FITC lysozyme體內(nèi)示蹤技術探索溶菌酶在魚體內(nèi)主要部位的吸收代謝規(guī)律。結(jié)果表明:(1)吉富羅非魚肝臟和胃腸道粗酶液對溶菌酶制品活性有明顯的抑制作用,隨反應時間延長,其相對保留率逐漸降低。溶菌酶在吉富羅非魚消化道各部位的相對保留率從高到低依次為后腸中腸胃肝臟前腸。說明其在吉富羅非魚后腸的耐受性最佳,在前腸最差。另外,該溶菌酶制品在L54組魚肝臟和胃中的相對保留率最高,并分別顯著高于L18、L72、L90組和L0、L18、L36組(P0.05)。(2)FITC lysozyme示蹤結(jié)果表明,吉富羅非魚單次口服溶菌酶48h內(nèi),其在魚體各部位的相對吸收率從高到低依次為中腸前腸后腸=胃=肝臟=中腎=血清肌肉,因此溶菌酶主要在吉富羅非魚腸道上半部被吸收(P0.05);此外,從溶菌酶在血清中的藥—時曲線圖上可以看出,此溶菌酶制品的血藥濃度可以維持12h,之后慢慢消除。綜上認為,后腸是溶菌酶的最適存活部位,而前腸和中腸是其主要吸收部位,其藥效發(fā)揮時間為12h。
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51(d) 4-1a-d 攝食含不同溶菌酶添加水平飼料的吉富羅非魚頭腎 C1、C2、C3 型溶NF-κB(P65)基因 mRNA 表達水平的變化ig. 4-1a-d Changes in levels of head-kidney C1-, C2-, C3-type lysozyme and NF-κmRNA of GITT tilapia fed different dietary lysozyme supplemented feeds

(d)4-2a-d 攝食含不同溶菌酶添加水平飼料的吉富羅非魚脾臟 C1、C2、C3 型NF-κBNF-κB(P65)基因 mRNA 表達水平的變化. 4-2a-d Changes in levels of spleen C1-, C2-, C3-type lysozyme and NF-κB(P6of GITT tilapia fed different dietary lysozyme supplemented feeds同溶菌酶添加水平對吉富羅非魚肝臟內(nèi)源 3 種 C 型溶菌酶和基因表達的影響料外源溶菌酶的添加對吉富羅非魚肝臟內(nèi)源性溶菌酶和 NF-的相對表達量產(chǎn)生了不同的回饋響應(圖 4-3a-d)。經(jīng)過 60d 的飼組魚的肝臟 3 種 C 型溶菌酶 mRNA 表達量均普遍高于對照組。C量在 L18 組顯著高于對照組，但在 L90 組顯著低于對照組(P<0溶菌酶的相對表達量均在 L54 組顯著高于對照組(P<0.05)，，同時溶菌酶也顯著高于對照組(P<0.05)；而NF-κB基因的相對表達量
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S965.125


本文編號：2650433