【摘要】：新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是我國(guó)南方石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的一種重要病毒性病原,近年頻繁爆發(fā)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大經(jīng)濟(jì)損失。在前期對(duì)SGIV分離、鑒定的基礎(chǔ)上,我們對(duì)其基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究,結(jié)果表明SGIV ORF088編碼的一個(gè)囊膜蛋白,初步實(shí)驗(yàn)揭示其可能在SGIV的黏附和侵入等過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但是其在病毒感染過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究利用重疊PCR和多片段同源重組等技術(shù)成功構(gòu)建了含有乳糖操縱子系統(tǒng)的SGIV ORF088誘導(dǎo)型表達(dá)重組病毒(Recombiannt virus 088, RV-088),通過(guò)IPTG誘導(dǎo)調(diào)控VP088基因的表達(dá)與缺失。分別通過(guò)嘌呤霉素篩選、流式細(xì)胞儀分選及連續(xù)梯度稀釋挑斑法進(jìn)行重組病毒的純化。獲得純化重組病毒后,病毒滴度實(shí)驗(yàn)表明,未加IPTG誘導(dǎo)的重組病毒(RV088-IPTG)比加入IPTG誘導(dǎo)的重組病毒(RV088+IPTG)的滴度顯著降低。進(jìn)一步基因轉(zhuǎn)錄分析表明,MCP、ORF136(LITAF)、ORF088、ORF086(ICP18)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平也顯著降低。盡管電鏡觀察結(jié)果表明,RV088-IPTG的病毒結(jié)構(gòu)形態(tài)與RV088+IPTG沒(méi)有顯著變化,但是對(duì)病毒的進(jìn)入特征研究表明,RV088-IPTG在病毒感染2h后進(jìn)入的數(shù)量顯著少于RV088+IPTG,由此推測(cè)VP088在SGIV病毒進(jìn)入過(guò)程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。綜上結(jié)果表明,我們成功建立用IPTG誘導(dǎo)含有乳糖操縱子系統(tǒng)的重組石斑魚虹彩病毒,為后期研究病毒的基因功能提供一種新的策略。在研究參與病毒進(jìn)入,裝配或釋放過(guò)程中的病毒囊膜蛋白的同時(shí),我們還嘗試尋找參與病毒感染的宿主蛋白。在純化SGIV病毒并進(jìn)行病毒蛋白質(zhì)譜鑒定的過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)有7種宿主細(xì)胞蛋白,包括細(xì)胞骨架微絲肌動(dòng)蛋白actin能夠在提純病毒過(guò)程中和病毒蛋白同時(shí)被純化,并且western印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)actin在純化病毒中存在,由此推測(cè)actin可能在病毒裝配或釋放過(guò)程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在病毒感染晚期,細(xì)胞變圓,大部分細(xì)胞微絲actin蛋白聚集到細(xì)胞表面,并且和SGIV病毒共定位。而且通過(guò)電鏡觀察表明,SGIV在裝配完成后,需要獲得宿主細(xì)胞質(zhì)膜成分才釋放形成完整的有囊膜的病毒顆粒。上述結(jié)果為actin在在病毒裝配與釋放過(guò)程中發(fā)揮著作用提供了一個(gè)佐證。接下來(lái)對(duì)actin和病毒蛋白相互作用的研究將進(jìn)一步揭示actin在病毒侵染中的作用機(jī)制。
【圖文】：

何利波等在鑒定ＲＧＶ邋ＴＫ和５３Ｒ等基因功能的基礎(chǔ)上，也分別構(gòu)建出缺失逡逑胸苷激酶（ＴＫ）基因和可誘導(dǎo)性表達(dá)５３Ｒ的重組蛙病毒Ａ邋ＴＫ－ＲＧＶ及逡逑ｉ５３Ｒ－ＲＧＶ－ｌａｃＩＯ如圖１．３（Ｈｅ邋ｅｋ／．，２０１２）。其最為主要的原件是阻遏蛋白和操縱逡逑子，阻遏蛋白能夠與操縱子序列特異性結(jié)合，覆蓋啟動(dòng)子區(qū)域，從而阻止了乳逡逑糖操縱子的基因轉(zhuǎn)錄（Ｂｅｌｌ邋ＣＥ，Ｌｅｗｉｓ邋Ｍ邋ｅ／邋ｄ邋，邋２０００）。除了能夠與ＩａｃＯ序列結(jié)合逡逑６逡逑

邐ｌａｄ邐ｇ＿ｐｔ邋ＩａｃＯ邐Ｊ１Ｒ逡逑圖１．邋２利用重組痘病毒研宄基因功能示意圖（Ｃｈｉｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００２）。逡逑（Ａ）構(gòu)建了一株可以表達(dá)Ｔ７聚合酶的重組病毒Ｖｔ７１ａｃＯＩ。用病毒早期啟動(dòng)子啟動(dòng)ｌａｄ逡逑的表達(dá)，病毒晚期啟動(dòng)子與ＩａｃＯ序列結(jié)合，用于啟動(dòng)Ｔ７的表達(dá)。上述原件均插入病毒ＴＫ逡逑基因中。（Ｂ）在病毒基因組上插入外源性的Ｊ１Ｒ基因。將外源性的Ｊ１Ｒ基因和抗性篩選基因逡逑插入病毒Ｖｔ７１ａｃＯＩ的非必須基因Ａ５６Ｒ上，構(gòu)建了一株重組病毒ＶｊｌＲ／ＩＪｌＲ。（Ｃ）構(gòu)建重組逡逑病毒ｖｉＪＩＲ。此病毒本身的Ｊ１Ｒ基因被ｌａｃＺ基因取代，插入的外源基因的Ｊ１Ｒ基因收ＩＰＴＧ逡逑的調(diào)控，其表達(dá)依賴于ＩＰＴＧ。逡逑Ｆｉｇ邋１．邋２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ邋ｂｙ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｖａｃｃｉｎｉａ逡逑ｖｉｒｕｓ．邋（Ｃｈｉｕ邋ｅｔ邋ａｌ．
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S941.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650393