【摘要】：中華絨螯蟹Eriocheir sinensis(俗稱河蟹、大閘蟹)是一種重要的淡水養(yǎng)殖蟹類,可創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而,隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展,由細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原引起的各種病害日益嚴(yán)重,給河蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。和其它無(wú)脊椎動(dòng)物一樣,中華絨螯蟹缺乏真正的適應(yīng)性免疫,只能依賴其先天免疫系統(tǒng)來(lái)識(shí)別病原,抵御病原侵染。因此,研究其免疫防御機(jī)制,尤其是免疫相關(guān)基因作用機(jī)制對(duì)于疾病防御具有重要意義。凝集素是一類可結(jié)合糖類物質(zhì)的蛋白,是甲殼動(dòng)物中一種重要的模式識(shí)別受體,但目前關(guān)于L-型凝集素(L-type lectins,LTLs)的功能研究卻很少。鈣結(jié)合蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,在Ca2+存儲(chǔ)、糖蛋白折疊和蛋白質(zhì)合成質(zhì)量控制中行使功能。最近研究發(fā)現(xiàn),鈣連蛋白(Calnexin,Cnx)和鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,Crt)作為凝集素樣分子伴侶,在細(xì)胞免疫中有一定作用。Toll信號(hào)通路具有重要的免疫功能,可調(diào)節(jié)抗菌肽的表達(dá),在抵御革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌入侵時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。MicroRNAs(miRNAs)是在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種短鏈非編碼RNA,參與包括免疫應(yīng)答在內(nèi)的許多生物學(xué)過(guò)程。有報(bào)道表明,病原入侵后可導(dǎo)致miRNA表達(dá)量發(fā)生變化,進(jìn)而調(diào)控其靶基因的表達(dá),在宿主與病原互作中發(fā)揮作用。為了闡明這些免疫相關(guān)基因在病原入侵后的具體作用機(jī)制,本研究選取兩種L-型凝集素(ERGIC-53和VIP36)、兩種凝集素樣分子伴侶(Cnx和Crt)及Toll信號(hào)通路中的異源三聚體(Myd88、Tube和Pelle),深入探討這些基因在中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)中的作用。另外,著重于研究WSSV利用中華絨螯蟹miR-7,抑制宿主的Myd88-ILF2-(IL-16L)抗病毒信號(hào)途徑,揭示miRNA在介導(dǎo)宿主和病原間相互作用的分子機(jī)制。本論文研究結(jié)果主要包括以下4個(gè)方面:1.中華絨螯蟹L-型凝集素的基因克隆和功能鑒定我們?cè)谥腥A絨螯蟹肝胰腺中克隆得到兩種L-型凝集素(EsERGIC-53和Es VIP36)。EsERGIC-53cDNA 全長(zhǎng) 1955 bp,包含一個(gè) 1506 bp 的開放閱讀框,編碼501個(gè)氨基酸。EsVIP36的cDNA全長(zhǎng)為3474 bp,開放閱讀框?yàn)?84 bp,編碼一個(gè)含327個(gè)氨基酸殘基的蛋白。預(yù)測(cè)的EsERGIC-53和EsVIP36蛋白都含有一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)L-型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。EsERGIC-53和EsVIP36分布廣泛,表達(dá)于所有檢測(cè)的河蟹組織中,且脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的刺激會(huì)引起其表達(dá)量的上調(diào)。體外重組表達(dá)的EsERGIC-53和EsVIP36 LTLD結(jié)構(gòu)域不能直接凝集細(xì)菌,但在Ca2+存在下能夠凝集多種革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌。EsERGIC-53-LTLD和EsVIP36-LTLD在不需要Ca2+參與的情況下不僅可以結(jié)合7種細(xì)菌,還能直接與病原菌表面的多糖(LPS、PGN、甘露糖D-Mannose和氮乙酸甘露糖胺N-Acetyl-D-mannosamine)結(jié)合。此外,當(dāng)與副溶血弧菌孵育結(jié)合后,EsERGIC-53-LTLD和EsVIP36-LTLD可以在河蟹體內(nèi)促進(jìn)機(jī)體對(duì)弧菌的清除作用。這些結(jié)果表明EsERGIC-53和EsVIP36作為模式識(shí)別受體積極參與了中華絨螯蟹的先天免疫應(yīng)答。2.中華絨螯蟹鈣連蛋白和鈣網(wǎng)蛋白的分子克隆和功能研究我們從中華絨螯蟹體內(nèi)鑒定了兩個(gè)鈣結(jié)合蛋白,命名為EsCnx和EsCrt。EsCnx的cDNA全長(zhǎng)為3175 bp,開放讀碼框?yàn)?797 bp可編碼598個(gè)氨基酸。EsCnx蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)鈣網(wǎng)蛋白結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。EsCrt全長(zhǎng)為1741 bp,1221 bp的開放讀碼框編碼406個(gè)氨基酸。EsCrt蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)鈣網(wǎng)蛋白結(jié)構(gòu)域和一個(gè)卷曲螺旋區(qū)域。在mRNA和蛋白水平上,EsCnx和EsCrt主要分布于血細(xì)胞、肝胰腺、鰓和腸中,細(xì)胞免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步顯示EsCnx和EsCrt主要定位于血細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。另外,熒光定量PCR和免疫印跡結(jié)果表明,EsCnx和EsCrt的表達(dá)量在受到脂多糖、肽聚糖、金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激后均呈上調(diào)趨勢(shì)。重組蛋白EsCnx和EsCrt不僅可以結(jié)合多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌,選擇性緊密結(jié)合于微生物表面的多糖(LPS和PGN),還可以在河蟹體內(nèi)加快機(jī)體對(duì)副溶血弧菌的清除速率。而利用RNA干擾沉默EsCnx或EsCrt的表達(dá)量會(huì)削弱河蟹對(duì)副溶血弧菌的清除效率。這些結(jié)果表明EsCnx和EsCrt作為模式識(shí)別受體,在中華絨螯蟹先天免疫中起到重要的防御作用。3.中華絨螯蟹Toll信號(hào)通路關(guān)鍵因子(Myd88、Pelle)的基因克隆和功能研究在本研究中,我們首次克隆得到了中華絨螯蟹髓樣分化因子88(My88)和Pelle基因(命名為EsMyd88和EsPelle)。EsMyd88全長(zhǎng)2210 bp,包括一個(gè)1416 bp的開放閱讀框可編碼472個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的EsMyd88蛋白包含一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域和一個(gè)白介素 1 受體(Toll-Interleukin 1 receptor,TIR)結(jié)構(gòu)域。EsPelle 全長(zhǎng)序列為3797 bp,含有3156 bp的開放閱讀框,編碼一個(gè)1051個(gè)氨基酸的多肽。預(yù)測(cè)的EsPelle蛋白含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域和一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。在健康河蟹的組織中,EsMyd88在血細(xì)胞和神經(jīng)中的表達(dá)量最高,而EsPelle在鰓、肝胰腺和血細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較高。在脂多糖、肽聚糖、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌或嗜水氣單胞菌感染的河蟹肝胰腺和血細(xì)胞中,EsMyd88和EsPelle的表達(dá)量顯著上調(diào)。Pull-down實(shí)驗(yàn)表明重組蛋白EsMyd88和EsTube之間存在直接的相互作用。在果蠅S2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EsMyd88、EsTube和EsPelle,能夠激活果蠅抗菌肽的啟動(dòng)子。在河蟹體內(nèi),RNA干擾沉默EsMyd88和EsPelle的表達(dá)后能夠抑制多種河蟹抗菌肽(抗脂多糖因子Anti-lipopolysaccharide factor,ALF、甲殼素Crustin和溶菌酶lysozyme)的表達(dá)。綜上,我們的研究結(jié)果說(shuō)明Toll信號(hào)通路關(guān)鍵因子EsMyd88、EsTube和EsPelle在河蟹體內(nèi)是真實(shí)存在的,并且發(fā)揮了類似于果蠅中的抗細(xì)菌防御作用。4.中華絨螯蟹miR-7調(diào)控Myd88在WSSV感染中的分子機(jī)制在本論文中,我們選擇分布廣泛、受到白斑病毒(white spot syndrome virus,WSSV)感染后表達(dá)量明顯上調(diào)的miR-7來(lái)探討miRNA在宿主與病毒互作中的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn),體外合成miR-7模擬物miR-7-mimic過(guò)表達(dá)miR-7后,能夠增加病毒拷貝數(shù),反之當(dāng)miR-7被反義核酸AMO-miR-7敲低后,病毒拷貝數(shù)明顯降低,說(shuō)明miR-7在病毒侵染過(guò)程中起促進(jìn)作用。通過(guò)三種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和單熒光報(bào)告質(zhì)粒靶基因驗(yàn)證系統(tǒng)的研究分析,miR-7可以直接靶向抑制宿主Myd88基因的表達(dá)。通過(guò)RNA干擾方法抑制Myd88的mRNA水平后,病毒拷貝數(shù)明顯增加。當(dāng)敲低Toll信號(hào)通路三個(gè)關(guān)鍵因子Myd88、Tube和Pelle的表達(dá)水平后,白介素增強(qiáng)子結(jié)合因子2(interleukin enhancer binding factor,ILF2)和白細(xì)胞介素-16(Interleukin-16,IL-16L)的表達(dá)量隨之顯著下調(diào),表明ILF2和IL-16L是依賴于Myd88的Toll信號(hào)通路的下游基因。過(guò)表達(dá)miR-7,更是可以抑制ILF2和IL-16L的表達(dá)。更有趣的是,ILF2作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可以調(diào)控IL-16L的表達(dá),并且IL-1dL在河蟹抗WSSV的過(guò)程中起著積極的應(yīng)答作用。我們的研究表明WSSV利用中華絨螯蟹miR-7,抑制宿主的Myd88-ILF2-(IL-16L)抗病毒信號(hào)途徑,從而進(jìn)行免疫逃逸,促進(jìn)病毒的復(fù)制。
【圖文】：

還具有多樣高效的適應(yīng)性免疫，且是隨著進(jìn)化漸趨完善的。然而，無(wú)脊椎動(dòng)逡逑物只能依賴于缺乏免疫抗體和免疫記憶的先天免疫系統(tǒng)，抵御外來(lái)病原體的感逡逑染。先天免疫主要包括三個(gè)部分：物理防御［４］、細(xì)胞免疫［５］和體液免疫［６］（圖１．１）。逡逑ＰＨＡＧＯＣＹＴＯＳＩＳ邋￣ＮＯＤＵＬＥ邋ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ逡逑ｉ邐ｊ邋ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ邋Ａ．Ｖ＂邐逡逑Ｄｉｓｅａｓｅ＊＊逡逑ｃａｕｓｉｎｇ邋ａｇｅｎｔｓ邐ＲＥＣ0ＧＮｍ0ＮｂｙＴ0ｉｉ逡逑ｂｒｅａｃｈ邋今咖工＝二．逡逑ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔ逡逑Ｈｕｍｏｒａｌ邋Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ邐Ｐｒｏ－邐Ｌｅｃｔｉｎｓ邋ａｎｄ逡逑！邋１邐ｐｅｐｔｉｄｅ邋（ＡＭＰ）邋ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ邋ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－逡逑ｅｖｅｎｔｓ邐ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邐ｃａｓｃａｄｅ邐ｌｉｋｅ邋ｆａｃｔｏｒｓ逡逑圖１．１無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫防御機(jī)制（引自Ｒｏｗｌｅｙ邋ａｎｄ邋Ｐｏｗｅｌｌ，２００７）邋［７］。逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｄｅｆｅｎｓｅ邋ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ邋ｏｆ邋ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ邋ｔｏ邋ｐａｒａｓｉｔｅｓ邋ａｎｄ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｓ邋（Ｆｒｏｍ逡逑Ｒｏｗｌｅｙ邋ａｎｄ邋Ｐｏｗｅｌｌ，邋２００７）［？］．逡逑１．１．１物理防御逡逑暴露于外環(huán)境中的體表致密結(jié)構(gòu)和消化道內(nèi)致密組織，可抵御病原微生物的逡逑入侵［８］。節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼主要是由幾丁質(zhì)與鈣鹽緊密結(jié)合而形成的

１．１．２細(xì)胞免疫逡逑細(xì)胞免疫是清除異源微生物的主要途徑，，通常是指由各種血細(xì)胞直接參與的逡逑免疫防御反應(yīng)（圖１．２），包括吞噻作用（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、包被作用（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）逡逑和結(jié)節(jié)形成（Ｎｏｄｕｌｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等［１（）］。根據(jù)血細(xì)胞大小、顆粒有無(wú)和多少，甲逡逑殼動(dòng)物的成熟血細(xì)胞可分為三類：無(wú)顆粒細(xì)胞（ａｇｒａｎｕｌａｒ邋ｃｅｌｌ，邋ＡＣ）或透明細(xì)胞逡逑（ｈｙａｌｉｎｅ邋ｃｅｌｌ，ＨＣ）邋［１１’１２］、半顆粒細(xì)胞（ｓｅｍｉ－ｇｒａｎｕｌａｒ邋ｃｅｌｌ，ＳＧＣ）邋［１３’１４］和顆粒細(xì)逡逑胞（ｇｒａｎｕｌａｒ邋ｃｅｌｌ，ＧＣ）邋［１５’１６］。透明細(xì)胞較小，呈卵圓形，無(wú)或含有極少顆粒，逡逑主要參與吞噬作用，在受到細(xì)菌或病毒感染的部位較易發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞；半顆粒細(xì)逡逑胞大多呈紡錘形或梭形，胞內(nèi)有少量的嗜伊紅顆粒，主要參與包被反應(yīng)；顆粒細(xì)逡逑胞通常呈大的圓形或卵圓形，胞內(nèi)含有較多嗜酸性顆粒，無(wú)吞噬作用，是儲(chǔ)存酚逡逑氧化酶激活系統(tǒng)組分的主要場(chǎng)所。半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在脂多糖或葡聚糖的誘逡逑導(dǎo)下會(huì)向胞外脫落顆粒
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4


本文編號(hào)：2646785