發(fā)布時(shí)間：2020-04-18 18:01

【摘要】：海洋生物是人類食物的重要來源。對(duì)蝦是其中一種重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)物,然而對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)易受到多種細(xì)菌和病毒的感染,遭受到巨大損失。因此,研究對(duì)蝦先天免疫機(jī)理,不僅可以為防治蝦病提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo),還能與模式生物的相關(guān)研究進(jìn)行比較,具有重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞是最小的生命系統(tǒng)組成單位,在其內(nèi)部的正常活動(dòng)與秩序的維持中,胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptor protein)起到不可忽視的作用。其正常的免疫活動(dòng),如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞免疫等等,都依賴于接頭蛋白才能有條不紊的進(jìn)行,因此,研究對(duì)蝦接頭蛋白在免疫過程中的功能對(duì)于我們進(jìn)一步了解對(duì)蝦的先天免疫機(jī)制和細(xì)胞中銜接蛋白的功能有重要的作用。Syntenin蛋白是一種含有兩個(gè)串聯(lián)的PDZ(首次在在突觸后密度蛋白PSD-95,DlgA和ZO-1中報(bào)道的重復(fù)序列)結(jié)構(gòu)域的多功能的胞質(zhì)內(nèi)接頭蛋白,能夠參與到細(xì)胞粘附,遷移,分化,凋亡以及在脊椎動(dòng)物的病毒的免疫反應(yīng)過程中。但是,目前關(guān)于Syntenin蛋白在無脊椎動(dòng)物的病毒免疫和細(xì)菌免疫方面的功能和具體作用機(jī)理沒有研究。本文選取了日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,克隆得到了Syntenin的同源基因,命名為MjSyn,并研究了該基因及其編碼的蛋白在對(duì)蝦免疫反應(yīng)中的功能及其作用機(jī)理。MjSyn的cDNA全長共1223bp,其完整開放閱讀框?yàn)?63 bp,共編碼320個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)MjSyn共包含兩個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域,一個(gè)N端區(qū)域和一個(gè)C端區(qū)域。MjSyn在對(duì)蝦各個(gè)組織中均有分布,并且在受到金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)刺激后,在不同時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的上調(diào)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),通過RNAi方法干擾對(duì)蝦體內(nèi)MjSyn的表達(dá)量后,對(duì)蝦對(duì)于細(xì)菌感染的清除能力下降了。利用血細(xì)胞吞噬熒光細(xì)菌的方法,表明干擾MjSyn影響了細(xì)胞對(duì)于細(xì)菌的吞噬能力,進(jìn)而影響了對(duì)蝦對(duì)細(xì)菌的清除能力。通過進(jìn)一步篩選吞噬相關(guān)基因,我們發(fā)現(xiàn)干擾MjSyn后,日本對(duì)蝦中的Calnexin(MjCnx)的mRNA和蛋白的表達(dá)都受到抑制,這表明MjSyn可能通過影響calnexin相關(guān)途徑來影響細(xì)胞的吞噬過程。在對(duì)蝦抗病毒免疫方面的研究中,我們發(fā)現(xiàn)干擾MjSyn后,病毒蛋白VP28在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制減少。而過表達(dá)MjSyn后,病毒蛋白VP28的復(fù)制增加。體外pull-down和體內(nèi)Co-IP實(shí)驗(yàn)證明,全長MjSyn可以結(jié)合病毒的囊膜蛋白VP24、 VP28和VP26。全長蛋白中,結(jié)構(gòu)域1+2與結(jié)構(gòu)域C(CTD)都能夠分別結(jié)合這三種病毒蛋白。另外,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦受到病毒刺激后,MjSyn向細(xì)胞膜遷移,呈極化分布,F-actin的遷移趨勢(shì)與MjSyn相吻合,因此兩者的共定位增加。值得注意的是,在病毒刺激后的血淋巴中能夠檢測(cè)到分泌出細(xì)胞外的MjSyn及VP28蛋白。這些結(jié)果表明,MjSyn通過結(jié)合病毒蛋白和調(diào)控F-actin的分布,促進(jìn)病毒釋放的過程來參與對(duì)蝦的病毒免疫。
【圖文】：

邐Ｉ逡逑０．１逡逑圖３．３不同物種的Ｓｙｎｔｅｎｉｎ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。物種的ＧｅｎＢａｎｋ號(hào)標(biāo)注在相應(yīng)的物種拉下名逡逑后面，Ａ（／Ｓｙｎ用一個(gè)黑色的Ｈ角符號(hào)標(biāo)示。該系統(tǒng)進(jìn)化樹（Ｎｅｒｇｈｂｏｒｉｎｇ－ｊｏｉｎｉｎｇ邋ｔｒｅｅ）用ＭＥＧＡ逡逑４．０軟件進(jìn)行１０００次計(jì)算來Ｗ確定結(jié)果的可重復(fù)性。逡逑Ｆｉｇ邋３．３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ａｎａｌｙｓｅ邋ｏｆ邋ｓｙｎ化ｎｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ＧｅｎＢａｎｋ邋ａｃｃｅｓｓｉｏｎ逡逑ｎｕｍｂｅｒｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋化ｅ邋ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ邋ｔｒｅｅ．邋＿Ａ＾Ｓｙｎ邋ｉｓ邋ｍａｒｋｅｄ邋ｗｉ化邋ａ邋ｂｌａｃｋ邋ｔｒｉａｎｇｌｅ．逡逑Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｍｉｎｇ邋ｔｒｅｅ邋ｗａｓ邋ｃｏｎｓｔｒｕｅ化ｄ邋ｕｓｉｎｇ邋ＭＥＧＡ邋４．０邋ｗｉ化邋ｏｎｅ邋化ｏｕｓａｎｄ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｐ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ逡逑化邋ｄｃ化ｒｍｉｎｅ邋化ｅ邋ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ．逡逑３、Ａ＾ｒ’Ｓｙｎ的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)逡逑用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ的算法，通過與人類的Ｓｙｎｔｅｎｉｎｌ進(jìn)行比對(duì)計(jì)算得到逡逑卸Ｓｙｎ的ＰＤＺ結(jié)構(gòu)域區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ＷＳｙｎ的ＰＤＺ結(jié)構(gòu)域逡逑部分包含兩個(gè)ａ－螺旋（ａｌ和ａ２），邐及五個(gè)Ｐ－折疊（ｐｉ到Ｐ５）（圖３．４Ｂ）。但是，逡逑人類的／／ｓＳｙｎ中的ＰＤＺ結(jié)構(gòu)域部分包含兩個(gè)ａ－螺旋和６個(gè)Ｐ－折屒（圖３．４邋Ａ）。逡逑將日本囊對(duì)郵和人類中的Ｓｙｎｔｅｎｉｎ的ＰＤＺ結(jié)構(gòu)域部分進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)

４、ＭｙＳｙｎ的重組表達(dá)及其在對(duì)郵組織中的組成性表達(dá)逡逑Ｍ／Ｓｙｎ的全長蛋白在化２１邋（ＤＥ３）中表這，并且經(jīng)Ｎｉ離子親和純化柱純化逡逑后，效果良好（圖３．５Ａ）。帶有Ｈｉｓ標(biāo)簽的Ｍｊ’Ｓｙｎ的重組蛋白大小約為３５ｋＤａ。逡逑利用半定量ＰＣ民和實(shí)時(shí)定量Ｑ－ＰＣＲ邋Ｗ及免疫印跡法檢測(cè)Ｍｙ’Ｓｙｎ在對(duì)化各個(gè)逡逑紀(jì)織中的表達(dá)分布，發(fā)現(xiàn)ＭｙＳｙｎ在各個(gè)組織中呈組成型表達(dá)，尤其是在鮑，腸，，逡逑胃和也中表達(dá)量較高（圖３．５邋Ｂ和Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｈｉｓ－ＳＹＮ逡逑Ａ邋－邋Ｖ；如；４邐Ｂ邐ｆｇｇｉ邋Ｈｆｅｍｏｃｙｔｆｃ邐Ｈ＂ｒｔ逡逑－一邋Ｓ＇］邐ＧＺａＣｉｌｌ邐Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ逡逑ｃ邐＿邐巧邋Ｈ巧ａｔｏｐａｎｃｒｅｊｉｓ邋四邋Ｔｅｓｔｅｓ逡逑Ｍ邋Ｉ邋皂邋２－簿四Ｊ邋Ｓｔｏｍａｃｈ邐四邋Ｏｖｔｒｙ逡逑邐＂邋｝｜邋Ｉ邋ｒｆｌｈ邋灥逡逑霉Ｓ邋—…，ｓ邋ｐ＇邋｜邐ｆ｜｜邋ａ逡逑一…

本文編號(hào)：2632371