【摘要】：甲殼動物高血糖激素家族在調(diào)控甲殼動物的變態(tài)發(fā)育、生殖、蛻皮、血糖平衡及體內(nèi)的滲透壓平衡等方面起著重要的作用,甲殼動物高糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone,CHH)和蛻皮抑制激素(Molt-inhibiting hormone,MIH)是甲殼動物高血糖激素家族中的兩個(gè)重要成員。本研究通過Genome walking和Tail-PCR方法克隆獲得了擬穴青蟹mih基因和chh基因的5’側(cè)翼區(qū)序列,然后對獲得的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,再通過構(gòu)建重組質(zhì)粒、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)對mih基因和chh基因的啟動子做了功能分析。主要研究結(jié)果如下:1)目前通過Genome walking和Tail-PCR方法克隆獲得的mih基因的5’側(cè)翼區(qū)序列,從翻譯起始位點(diǎn)(ATG)起共2024 bp。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是位于ATG上游的第207個(gè)堿基“A”,在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A)上游33 bp處有一個(gè)TATA box;潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)包括Ap-1、Sp1、NF-1、Oct-1、RAP1、Sox-2、C/EBPalp、NF-κappaB、GATA-1等;有兩個(gè)CpG島,分別位于-25 bp—+183 bp及-1451 bp—-1316 bp。2)目前通過Genome walking和Tail-PCR方法克隆獲得的chh基因的5’側(cè)翼區(qū)序列,從翻譯起始位點(diǎn)(ATG)起共657 bp。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是位于ATG上游的第74個(gè)堿基“A”,在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(A)上游31 bp處有一個(gè)TATA box;潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)包括Oct-1、C/EBPalp、GATA-1、Sp1、Ap-1、NF-κappaB、NF-1、RAP1、HNF-3等;沒有CpG島。3)mih基因啟動子不同長度片段在HEK293T細(xì)胞和Sf9細(xì)胞中的活性分析結(jié)果顯示,在-1350 bp—-889 bp之間、-308 bp—-26 bp之間都存在重要的調(diào)控序列。對-1350 bp—-889bp之間預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)突變和活性分析,發(fā)現(xiàn)NF-κB在調(diào)控mih基因的表達(dá)過程中可能起促進(jìn)作用。對-308 bp—-26 bp之間預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子RAP1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)缺失和活性分析,發(fā)現(xiàn)RAP1可能正調(diào)控mih基因的表達(dá)。4)在研究mih基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星序列(CA)n多態(tài)性對啟動子活性的影響中發(fā)現(xiàn),含CA(n=11)的片段的活性最高,含CA(n=10)的片段的活性高于含CA(n=12)的片段。5)chh基因啟動子不同長度片段在HEK293T細(xì)胞和Sf9細(xì)胞中的活性分析結(jié)果顯示,在-286 bp—-46 bp、-583 bp—-388 bp區(qū)域可能存在負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),在-388 bp—-286 bp區(qū)域可能存在正調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
【圖文】：

大學(xué)碩士學(xué)位論文 擬穴青蟹mih基因和chh基因啟動子的功是熱穩(wěn)定的肽類物質(zhì)，有許多生化性質(zhì)方面的相似處。由于 CHH 家族神經(jīng)肽成上相似，且在功能上有多樣性，所以推測多種神經(jīng)肽激素綜合調(diào)控著甲殼動物的育[11-13]。CHH 家族在調(diào)控甲殼動物一系列重要的生理活動中起著關(guān)鍵作用，如能蛻皮、血糖平衡、性成熟以及對環(huán)境的適應(yīng)代謝等（圖 1-1），，因此一直是神經(jīng)內(nèi)研究熱點(diǎn)[14]。

可以使某些基因特異性表達(dá)或抑制，控制特定基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和發(fā)育等[53,54]。因此對基因啟動子進(jìn)行功能分析對于揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制具有重要意義。1.5.1 真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)啟動子是結(jié)構(gòu)基因的重要組成部分，調(diào)控著基因的表達(dá)。然而啟動子本身并不能調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，而是通過與相應(yīng)的反式作用元件（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合，并在 RNA 聚合酶的作用下才能啟動對基因的表達(dá)調(diào)控。RNA 聚合酶可分為 3 類，真核生物的啟動子為 RNA 聚合酶 II 型啟動子，這類啟動子主要涉及編碼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)調(diào)控[55]。一般來說，啟動子是由一個(gè)核心啟動子區(qū)和一個(gè)調(diào)控區(qū)組成的。核心啟動子區(qū)大約100bp 左右，一般位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近，主要包含起始子（Initiator，Inr）、TATA 盒、TFII特異性識別元件（TFIIB recognition element，BRE）、下游啟動子元件（Downstream promotelement，DPE）及十基序元件（Motif- ten element，MTE），整合了所有參與促進(jìn)轉(zhuǎn)錄或抑制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子（圖 1-2）[56-59]。有一種啟動子是由 CpG 島構(gòu)成而并不含有 TATAboxCpG 島在基因表達(dá)的調(diào)控和細(xì)胞分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[60]。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2628618