【摘要】：金錢魚(Scatophagus argus)為廣溫、廣鹽性魚類,廣泛分布于太平洋地區(qū)的海水中。因其環(huán)境耐受力強(qiáng),已成為近年來(lái)在中國(guó)南部深受歡迎的優(yōu)質(zhì)海水經(jīng)濟(jì)魚類。為探究金錢魚MHC II類基因的結(jié)構(gòu)與特性,本研究采用同源克隆和RACE等技術(shù),在獲得金錢魚MHC IIα和β基因cDNA全序列的基礎(chǔ)上,分析其內(nèi)含子序列、基因多態(tài)性和感染細(xì)菌前后的組織表達(dá)情況,為今后金錢魚抗病基因的篩選以及抗病育種提供依據(jù)。本研究的主要結(jié)果如下:1金錢魚MHC IIα基因結(jié)構(gòu)、多態(tài)性及組織表達(dá)分析采用同源克隆和RACE等技術(shù),獲得長(zhǎng)度為1319 bp的金錢魚MHC IIα基因的cDNA全序列(Genebank號(hào):KT005411),命名為Scar-DXA*01。分析發(fā)現(xiàn):金錢魚MHC IIα基因與其他硬骨魚類的結(jié)構(gòu)域類似,由信號(hào)肽(SP)、兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(α1、α2)、連接肽、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)等結(jié)構(gòu)域組成。它的ORF共編碼242個(gè)氨基酸,分子組成為C2145H3563N729O895S177,分子量59.56kDa;等電點(diǎn)為5.12。該基因包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,外顯子1編碼58bp的5`-UTR和73bp的信號(hào)肽,外顯子2編碼α1結(jié)構(gòu)域,外顯子3編碼α2結(jié)構(gòu)域,外顯子4編碼連接肽、跨膜區(qū)、胞質(zhì)區(qū)以及537bp的3`-UTR。內(nèi)含子1長(zhǎng)度為246bp,它把外顯子1和外顯子2分開;內(nèi)含子2緊跟著外顯子2,長(zhǎng)度為590bp;內(nèi)含子3長(zhǎng)度為91bp。所有內(nèi)含子與外顯子的匹配位點(diǎn)均為gt/ag。經(jīng)Predict Protein預(yù)測(cè),金錢魚MHC IIα基因蛋白質(zhì)的主要功能位點(diǎn)如下:在α2區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(NVSW),在α1、α2和CP/TM/CYT區(qū)共發(fā)現(xiàn)6個(gè)N-豆蔻�；稽c(diǎn)(GCSDSD、GVQVTE、GTSTNV、GVGPAV、GLGLTD和GVAAGT),在α2區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)蛋白激酶C-磷酸化位點(diǎn)(SFR、TSR、TVR),在α1和α2區(qū)共有4個(gè)酪氨酸激酶II-磷酸化位點(diǎn)(SQHE、SDSD、SFID和SRLE)。從43尾健康魚的209個(gè)陽(yáng)性克隆中,獲得209條不同編碼的核苷酸序列,都包含完整的SP、α1和α2結(jié)構(gòu)域,CP、TM及CYT,分別編碼163條不同的氨基酸序列。根據(jù)等位基因命名規(guī)則,可將它們歸為40個(gè)等位基因主型及94個(gè)等位基因亞型,分別命名為scar-dxa*0101~scar-dxa*4001(genbank號(hào):kt176102~kt176141)。分析數(shù)據(jù)得知,金錢魚mhciiα基因的核苷酸序列中有143個(gè)變異位點(diǎn),變異率達(dá)20.46%,其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有112個(gè);而氨基酸序列中有69個(gè)變異位點(diǎn),變異率達(dá)29.61%,其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有54個(gè)。另外,金錢魚mhciiβ基因的單倍型多樣度(hd)、平均核苷酸差異數(shù)目(k)和核苷酸多樣度(pi)分別為1.000、45.219和0.065。rt-pcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn),金錢魚mhciiα基因在所檢測(cè)的11種組織中均有表達(dá),其中在皮、腸、脾、肌和鰓中的表達(dá)量較高,中等程度表達(dá)于胃、腦、心和腎等組織,而在肝和眼中的表達(dá)量較低。人工感染嗜水氣單胞菌后,mhciiα基因在不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間段內(nèi),于腸、皮、肝、腎、鰓、脾等組織中的表達(dá)量均發(fā)生不同程度的變化:腸、脾、皮、鰓和腎組織的表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)波動(dòng)情況,且均低于對(duì)照組;肝組織在24h~48h中的表達(dá)量低于對(duì)照組,但在12h、72h的表達(dá)量卻明顯高于對(duì)照組。2金錢魚mhciiβ基因結(jié)構(gòu)、多態(tài)性及組織表達(dá)分析采用同源克隆和race等技術(shù),獲得長(zhǎng)度為1172bp的金錢魚mhciiβ基因的cdna全序列(genebank號(hào):kt176142),命名為scar-dxb*01。分析表明:金錢魚mhciiβ基因與其他硬骨魚類的結(jié)構(gòu)域類似,由信號(hào)肽(sp)、兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(β1、β2)、連接肽、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)等結(jié)構(gòu)域組成。它的orf共編碼249個(gè)氨基酸,分子組成為c2239h3730n750o934s198,分子量62.45kda;等電點(diǎn)為5.09。該基因包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,外顯子1包括34bp的5`-utr和55bp的信號(hào)肽,外顯子2編碼β1結(jié)構(gòu)域,外顯子3和4編碼β2結(jié)構(gòu)域,外顯子5和6編碼連接肽、跨膜區(qū)、胞質(zhì)區(qū)以及388bp的3`-utr。內(nèi)含子1長(zhǎng)度為216bp,它把外顯子1和外顯子2分開;內(nèi)含子2緊跟著外顯子2,長(zhǎng)度為1010bp;內(nèi)含子3把β2結(jié)構(gòu)域分開,長(zhǎng)度為85bp;內(nèi)含子4和5長(zhǎng)度分別為258bp和94bp。所有內(nèi)含子與外顯子的匹配位點(diǎn)均為gt/ag。經(jīng)predictprotein預(yù)測(cè),金錢魚mhciiβ基因蛋白質(zhì)的主要功能位點(diǎn)如下:在β1區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)n-糖基化位點(diǎn)(nste),在β1、β2區(qū)和CP/TM/CYT區(qū)發(fā)現(xiàn)4個(gè)N-豆蔻�；稽c(diǎn)(GNFVGY、GLMYAE、GQEVTS、GLILGL),在β2區(qū)、CP/TM/CYT區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)蛋白激酶C-磷酸化位點(diǎn)(TPR、SLK、SER),在β2區(qū)和CP/TM/CYT區(qū)共有5個(gè)酪蛋白激酶II-磷酸化位點(diǎn)(SVFD、TSTD、SHLE、TDWD、SMPE),在β1區(qū)存在一個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(KVEDVGY)。從43尾健康魚的209個(gè)陽(yáng)性克隆中,獲得209條不同編碼的核苷酸序列,都包含完整的SP,β1和β2結(jié)構(gòu)域,CP、TM及CYT,分別編碼179條不同的氨基酸序列。根據(jù)等位基因命名規(guī)則,可將它們歸為48個(gè)等位基因主型及96個(gè)等位基因亞型,分別命名為Scar-DXB*0101~Scar-DXB*4801(GenBank號(hào):KT176142~KT176189)。分析得知,金錢魚MHC IIβ基因的核苷酸序列中有183個(gè)變異位點(diǎn),變異率達(dá)25.74%,其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有139個(gè);而氨基酸序列中有83個(gè)變異位點(diǎn),變異率達(dá)35.02%,其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有62個(gè)。另外,金錢魚MHC IIβ基因的單倍型多樣度(HD)、平均核苷酸差異數(shù)目(K)和核苷酸多樣度(PI)分別為1.000、57.480和0.081。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),金錢魚MHC IIβ基因在所檢測(cè)的11種組織中均有表達(dá),其中在脾、鰓、腸和皮膚中表達(dá)量較高,中等程度表達(dá)于腎、胃、心,而在眼、腦、肝、肌肉中表達(dá)量較低。對(duì)健康金錢魚人工感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后,發(fā)現(xiàn)其MHC IIβ基因在肝、脾、鰓、腎、皮和腸等組織中的表達(dá)量均發(fā)生了不同程度的變化:鰓、腸和脾組織的表達(dá)量,在12h~48h均低于對(duì)照組的表達(dá)量,但在72h的表達(dá)量卻明顯高于對(duì)照組;腎和皮組織的表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)波動(dòng)情況,且均低于對(duì)照組;肝組織在12h~24h中的表達(dá)量低于對(duì)照組,但在48h~72h的表達(dá)量卻明顯高于對(duì)照組。
【圖文】：

究概況物學(xué)特征tophagus argus)俗稱金鼓魚，是廣泛分布于太平洋地區(qū)性魚類[1-2]。它隸屬鱸形目(Perciformes)，鱸亞目(Percidae)，金錢魚屬(Scatophagus)。國(guó)際上，金錢魚科僅金，另外兩種分別為多帶金錢魚(Scatophagus multifascagus tetracanthus)[3]，，而生活在東南沿海的金錢魚是我[4]。，口小，近前位，兩領(lǐng)齒呈細(xì)剛毛刷狀且?guī)钆帕小Ｉw膜與峽部稍連。體高側(cè)扁，側(cè)面呈圓盤形，背部高黃褐色，體表滿布黑色圓斑似金錢狀，腹部銀白，尾、被小櫛鱗，側(cè)線完全。一般魚體長(zhǎng) 10cm，成魚體長(zhǎng) 16-18 枚，在臀鰭中有 13-15 枚；硬棘在背鰭中有 10腹鰭及背鰭的鰭棘中有毒腺，被蜇傷后蟄傷處通常會(huì)

圖 1-1 金錢魚 MHC II α基因的基因組序列(A)和示意圖(B)[57]（A）大寫字母表示外顯子，小寫字母表示內(nèi)含子。數(shù)字表示該行末尾的核苷酸位點(diǎn)數(shù)；加粗?jǐn)?shù)字表示該行末尾的氨基酸位點(diǎn)數(shù)；點(diǎn)虛線代表信號(hào)肽區(qū)域；下劃線代表蛋白激酶 C 磷酸化位點(diǎn)；橫虛線表示 N 糖基化位點(diǎn)，圓角框表示酪蛋白激酶 II 磷酸化位點(diǎn)；灰色方框表示N-豆蔻酰基化位點(diǎn)；直角方框表示加尾信號(hào)和 PolyA 尾巴；陰影部分表示內(nèi)含子與外顯子的匹配位點(diǎn)；橢圓表示起始和終止密碼子。（B）方框代表外顯子；橫線代表內(nèi)含子；白色方框代表編碼區(qū)；黑色方框代表非編碼區(qū)，數(shù)字代表內(nèi)含子或者外顯子的堿基長(zhǎng)度。Fig.1-1 Genomic sequence (A) and schematic illustration (B) of theS. argus MHC II α gene.(A)Exons are shown in uppercase and introns are in lowercase letters. Numbers are representativeof the end of nucleotide sequence ( non-bold ) and deduced amino acid sequence (in bold);dot-dashed line stand for signal peptide; underline indicate Protein kinase C phosphorylation site;horizontal dotted line indicates N-glycosylation site ; rounded rectangle indicate Casein kinase IIphosphorylation site ; Grey box indicate N -nutmeg acetoxylation site site. Rectangular box arerepresentative of the polyadenylation signal and the polyA tail;dash area indicate introns and exonsmatching sites;ellipse indicate the start codon and stop codon.(B) Comparison of MHC IIα gene structures of the spotted scat and other species. Boxes stand for
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2625922