【摘要】：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一種在水產(chǎn)品中常見的機(jī)會性致病菌,主要分布在海洋、海口和河口沉積物中,能夠黏附在魚、蝦、貝類等水產(chǎn)品的體表,導(dǎo)致水產(chǎn)品弧菌病,危害水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)。人類誤食被副溶血性弧菌污染的水產(chǎn)品后可以引發(fā)食物中毒,由該菌引起的食物中毒事件在全世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生,該菌已經(jīng)被認(rèn)為是微生物性食物中毒的主要病原菌之一。副溶血性弧菌具有眾多的致病因子,溶血素、脲酶、黏附因子、分泌系統(tǒng)等都在其致病性中發(fā)揮著不同的作用。目前對于副溶血性弧菌分泌系統(tǒng)的研究還不成熟,對于副溶血性弧菌的全基因組測序可知副溶血性弧菌存在兩套T3SS和兩套T6SS。對于其在臨床和環(huán)境分離株中的分布研究大多僅限于結(jié)構(gòu)基因,而分泌系統(tǒng)主要發(fā)揮作用的是其效應(yīng)蛋白,而對于效應(yīng)蛋白基因在其中的分布情況還知之甚少。而T6SS被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)菌種內(nèi)競爭的因素,在副溶血性弧菌中種內(nèi)競爭是否普遍存在,以及T6SS在副溶血性弧菌種內(nèi)競爭中的作用研究還不明確。本文進(jìn)行了如下的研究工作:(1)探究食品與臨床分離的副溶血性弧菌分泌系統(tǒng)相關(guān)基因攜帶情況;(2)探究攜帶不同分泌系統(tǒng)的菌株在混合培養(yǎng)下的生長差異;(3)探究溫度、培養(yǎng)時間及接種量對混合培養(yǎng)條件下副溶血性弧菌種內(nèi)競爭的影響;(4)探究混合培養(yǎng)對于T6SS相關(guān)基因表達(dá)量的影響。本研究的主要內(nèi)容和研究結(jié)果如下:1.副溶血性弧菌T6SS和T3SS相關(guān)基因在副溶血性弧菌中的分布運(yùn)用PCR技術(shù)對85株不同來源的副溶血性弧菌(44株臨床分離株、41株環(huán)境分離株)的T6SS相關(guān)基因以及T3SS相關(guān)基因進(jìn)行檢測,分析其致病基因的攜帶情況。結(jié)果顯示,所有菌株均攜帶T3SS1結(jié)構(gòu)基因和T6SS2結(jié)構(gòu)基因。在所測85株菌中34株含有全部所測T6SS基因,其中32株為tdh~+菌株(包含tdh~+/trh~+和tdh~+/trh~-基因型),2株tdh~-菌株(tdh~-/trh~+和tdh~-/trh~-),T6SS1基因簇在不同菌株中具有多樣性。tdh~+菌株攜帶T3SS2的占80%,而tdh~-菌株中并不含有T3SS2基因。臨床分離株中大多為同時攜帶T3SS2和T6SS1結(jié)構(gòu)基因的菌株,而環(huán)境株中多為同時不攜帶兩種基因的菌株。并且,攜帶T3SS2與T6SS1結(jié)構(gòu)基因的菌株基本都攜帶tdh基因,tdh~+菌株與tdh~-菌株在T3SS2與T6SS1基因攜帶情況存在顯著性差異,顯示出一定的相關(guān)性。vop Q和vop A/P基因在T3SS1陽性和T3SS2陽性菌株中分別表現(xiàn)出了不同程度的缺失。效應(yīng)蛋白具有不同程度的缺失,部分提示了不同菌株在毒力上的差異。2.不同副溶血性弧菌混合培養(yǎng)下的數(shù)量變化利用熒光定量PCR技術(shù),以tdh和trh為靶基因建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定菌落數(shù)與C_T值之間的關(guān)系,以是否攜帶T6SS1基因?yàn)榉诸?測定不同副溶血性弧菌在混合培養(yǎng)后的數(shù)量變化,結(jié)果顯示,在副溶血性弧菌中存在兩種生存模式:(1)一株菌抑制另一株菌的生長,其中具有數(shù)量優(yōu)勢的菌株數(shù)量范圍在9.31-9.58 log_(10) CFU/mL,劣勢菌只有3.27-3.98 log_(10) CFU/mL,并且優(yōu)勢菌株均為T6SS1~+基因型菌株;(2)兩株菌兼容共生,兩株菌的數(shù)量范圍在8.12-9.14 log10 CFU/mL之間。在混合培養(yǎng)條件下,部分T6SS1~+的副溶血性弧菌菌株存在明顯的種內(nèi)競爭優(yōu)勢,能夠抑制其他菌株的生長。3.探究溫度、培養(yǎng)時間、接種量對種內(nèi)競爭的影響將混合后的副溶血性弧菌分別在30℃與37℃下進(jìn)行培養(yǎng),探究溫度對種內(nèi)競爭的影響,結(jié)果表明30℃時更有利于種內(nèi)競爭作用。對混合培養(yǎng)4 h、8 h、12 h和24 h后的副溶血性弧菌進(jìn)行數(shù)量檢測,發(fā)現(xiàn)基本在培養(yǎng)8 h后,優(yōu)勢菌株與劣勢菌的數(shù)量差異更大。并且比較了1:1和1:4接種量條件下混合培養(yǎng)后菌株的數(shù)量變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)種內(nèi)競爭的組別中,增加了劣勢菌比例,混合培養(yǎng)后的菌株數(shù)量差異更大,這更加證實(shí)了造成混合培養(yǎng)下,數(shù)量差異的原因是由于細(xì)菌之間的相互作用而不是細(xì)菌的生長特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在相較于37℃的人體溫度,溫暖的海洋環(huán)境更利于種內(nèi)競爭的發(fā)生,并且在對數(shù)生長后期種內(nèi)競爭作用更明顯,這表明種內(nèi)競爭作用可能與環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)。4.混合培養(yǎng)前后對T6SS相關(guān)基因的表達(dá)有研究表明在許多革蘭氏陰性菌中T6SS都是介導(dǎo)種內(nèi)競爭的主要原因,而前文也證實(shí)了在副溶血性弧菌中確實(shí)存在種內(nèi)競爭現(xiàn)象,我們通過RT-qPCR方法對混合培養(yǎng)前后T6SS相關(guān)基因表達(dá)量的分析對出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因進(jìn)行初步的探索,基因表達(dá)分析結(jié)果顯示,較單一培養(yǎng)的菌株,混合培養(yǎng)中副溶血性弧菌T6SS1和T6SS2相關(guān)基因的表達(dá)量均有明顯的上調(diào)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是,在混合培養(yǎng)的條件下,副溶血性弧菌可通過增強(qiáng)自身T6SS1和T6SS2相關(guān)基因的表達(dá),以提升其在種內(nèi)的競爭力,這為研究T6SS在副溶血性弧菌介導(dǎo)種內(nèi)競爭的作用提供線索。
【圖文】：

分泌系統(tǒng)的分泌機(jī)制可以分為一步分泌機(jī)制(One-step secretionmechanism)和兩步分泌機(jī)制(Two-step secretion mechanism)。其中，Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型為一步分泌系統(tǒng)，而兩步分泌系統(tǒng)則包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅷ型和Ⅸ型五類分泌系統(tǒng)。在副溶血性弧菌分泌系統(tǒng)中只有 T3SS 和 T6SS 被研究，其他分泌系統(tǒng)均未見詳細(xì)報道。副溶血性弧菌的 T3SS 和 T6SS 同屬于雙膜鑲嵌分泌系統(tǒng)，其效應(yīng)物通過一步分泌機(jī)制直接從細(xì)胞質(zhì)被靶定至胞外或宿主細(xì)胞內(nèi)，，進(jìn)而導(dǎo)致宿主感染。2.3.1 副溶血性弧菌 T3SS 及調(diào)控機(jī)制T3SS 是一種多亞基的針狀結(jié)構(gòu)，用于將效應(yīng)物直接遞送到宿主細(xì)胞中，發(fā)揮毒力作用。研究發(fā)現(xiàn) III 型分泌系統(tǒng)對于 TDH 和 TRH 協(xié)同致病過程中具有重要作用[15]。T3SS 存在于大多數(shù)革蘭氏陰性菌中，副溶血性弧菌含有 2 套Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS），分別為 T3SS1（vp1656-1702）和 T3SS2（vpa1321-1731），后者可以細(xì)分為 T3SS2ɑ 和 T3SS2β，其效應(yīng)物在致病力中的作用如圖 1-1 所示。

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文種內(nèi)競爭[60]。而更多的研究顯示在菌株中，尤其是海洋弧菌中，T6SS 具有眾多抗菌 1-2 不僅介導(dǎo)種間競爭還參與種內(nèi)競爭[61]。研究表明在費(fèi)氏弧菌（eri, Vf）中，分為致死菌株和非致死菌株，非致死菌株可以共存，致死菌6SS2 接觸依賴介導(dǎo)種內(nèi)競爭；兩種致死菌株的競爭結(jié)果包括：一株殺死相互兼容的穩(wěn)定共存；或相互抑制共存[3]�；魜y弧菌（Vibriocholerae,V 個不同的 T6SS，霍亂弧菌利用 T6SS 可以特異性的抑制革蘭氏陰性菌，桿菌、哈維弧菌、交替假單胞菌等，并且霍亂弧菌的 T6SS 具有殺死具有S 效應(yīng)模塊的菌株的作用[62]。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S941.42

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉海泉;劉冰宣;呂利群;潘迎捷;謝晶;趙勇;;上海市生食三文魚中副溶血性弧菌污染的風(fēng)險分析[J];食品科學(xué);2015年24期

2 毛雪丹;胡俊峰;劉秀梅;;用文獻(xiàn)綜述法估計我國食源性副溶血性弧菌病發(fā)病率[J];中華疾病控制雜志;2013年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 俞盈;副溶血弧菌VI型分泌系統(tǒng)功能及其調(diào)控[D];浙江大學(xué);2012年

本文編號：2625517