【摘要】：本文通過對WSSV囊膜VP110序列進(jìn)行blast和alignment分析后發(fā)現(xiàn),vp110和pif2有相似性,而pif2是桿狀病毒經(jīng)口侵染因子。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn),VP110和PIF2均在N端有高疏水性區(qū)域,且為跨膜區(qū)。我們將WSSV VP110與昆蟲DNA病毒Baculoviruses、Nudiviruses、Hytrosaviruses等的PIF2蛋白序列最相似的,不包含疏水性較高的N端區(qū)域的150到600aa定義為s VP110,將其基因序列克隆到p ET-16b表達(dá)載體上。對表達(dá)條件如溫度、時間、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化,高表達(dá)無斷裂的融合蛋白s VP110-His,經(jīng)GE蛋白純化儀AKTA Pure系統(tǒng)純化后,蛋白純度達(dá)到80%以上。復(fù)性條件經(jīng)過不斷探索、優(yōu)化后,選擇了最佳復(fù)性條件6 mol/L的尿素溶液4℃透析1 h,接著使用4 mol/L尿素溶液透析4 h,最后用2 mol/L尿素溶液透析2 h,成功完成透析復(fù)性。使用超濾管超濾濃縮復(fù)性成功的蛋白s VP110-His,得到高濃度、高親水性的s VP110-His蛋白,濃度達(dá)到600.83 mg/m L,總量完全滿足制備兔源多克隆抗體的要求(≥3mg)。將制備成功的融合蛋白s VP110-His作為抗原免疫兔子,成功的制備出特異性高,親和性好的多克隆抗體,抗體的效價達(dá)到1:23,000。這為進(jìn)一步驗證WSSV的經(jīng)口侵染以及VP110與圍食膜蛋白的相互作用打下了基礎(chǔ)。我們將VP110功能區(qū)域(150aa-610aa)構(gòu)建到載體p QE80-ZZtev、p ET-16b、p GEX-4T1和p ET-32a,經(jīng)過對原核表達(dá)的條件的摸索:如改變誘導(dǎo)溫度、嘗試低溫表達(dá)、誘導(dǎo)時間延長及縮短、誘導(dǎo)劑濃度的摸索(1 mmol/L、0.1 mmol/L);嘗試不同的表達(dá)菌株BL21、Rosetta和Origami B;最終用N端帶有提高蛋白可溶性的硫氧還原蛋白標(biāo)簽和兩端均有用于純化的his標(biāo)簽的p ET-32a載體,成功的表達(dá)出可溶性融合蛋白s VP110-Trx,并對其進(jìn)行了純化優(yōu)化摸索,得到可溶性的融合蛋白s VP110-Trx。本文在研究過程中,嘗試表達(dá)VP110全長蛋白。選用了不同的表達(dá)載體、不同表達(dá)菌株,并對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,VP110全長以包涵體形式表達(dá)。上清中含量極微或者完全檢測不到。三種表達(dá)菌株BL21、Rosetta和Origami B中,Rosetta的表達(dá)能力最好,BL21次之,Origami B最差。三株菌的最適表達(dá)條件均為1 mmol/L的IPTG和30℃的誘導(dǎo)溫度。三個不同標(biāo)簽的表達(dá)載體p GEX-4T1、p ET-16b、p ET-32a中,p ET-32a的融合蛋白VP110-Trx的表達(dá)量在同樣條件下最高,p ET-16b的融合蛋白VP110-His的表達(dá)量次之,p GEX-4T1的融合蛋白VP110-GST表達(dá)量最低。盡管優(yōu)化表達(dá)后,VP110始終以包涵體的形式表達(dá),然而,我們是首次獲得VP110全長表達(dá)。
【圖文】：

1 對蝦白斑綜合征病毒簡介對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，，WSSV)1992 年發(fā)現(xiàn)于臺灣，隨后在中國[1]、日本[2]、韓國[3]、泰國[3]、印度[4]、美國[5]、法國[6]等世界各國都有暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失如圖 1 所示[7]。

圖 2 有白色斑點(diǎn)的 WSSV 侵染的斑節(jié)對蝦的甲殼（a）和腹段最后部分（b）Fig. 2 White spot syndrome virus infected Penaeus monodon showing white spot symptoms oncarapace (a) and last abdominal segment (b)WSSV 是 Nimaviridae 科 Whispovirus 屬的唯一種[10, 11]，雙鏈 DNA 病毒，上傳的基因組序列有中國臺灣株(WSSV-TW)[12]、大陸株(WSSV-CN)[13]、泰國株(WSSV-TH)[14]和韓國株(WSSV-KR)[15]，基因組大小約 300 kb，是海洋病毒最大基因組之一。WSSV 病毒粒子外形像桿狀大約有 210-420nm，內(nèi)有 19nm 厚的核衣殼，外有 6-7nm 厚的囊膜包裹，病毒粒子的一端有類似尾的附著器[16, 17]。2 對蝦白斑綜合征病毒研究進(jìn)展2.1 對蝦白斑綜合征病毒環(huán)境控制研究進(jìn)展WSSV 的宿主主要是甲殼類動物，宿主生活環(huán)境在無論是淡水還是海水，其
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S945.1

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 陰曉麗;李卓佳;管淑玉;溫為庚;郭志勛;;番石榴葉水提取物抗對蝦白斑綜合征病毒有效成分初探[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年13期

2 向峗;王剛;陳兆明;張銳;孫成波;;亞硝酸氮濃度變化對感染白斑綜合癥病毒的凡納濱對蝦的影響[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年30期

3 向峗;吳宇學(xué);王剛;陳兆明;張銳;孫成波;;不同溫度下哈維氏弧菌和白斑綜合癥病毒對凡納濱對蝦的致病性[J];大連海洋大學(xué)學(xué)報;2015年01期

4 向峗;王剛;葉國鋒;陳兆明;楊世平;王成桂;孫成波;;鹽度變化對攜帶白斑綜合癥病毒(WSSV)的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的影響[J];海洋與湖沼;2014年02期

5 秦曉峰;蔣太交;程根宏;;抵御新發(fā)、突發(fā)病毒性傳染病的新思路——天然免疫機(jī)制的系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究和針對宿主的廣譜抗病毒藥物的研發(fā)[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2015年01期

6 向峗;王剛;龔永;陳兆明;張銳;孫成波;;氨氮質(zhì)量濃度對感染白斑綜合癥病毒的凡納濱對蝦的影響[J];熱帶生物學(xué)報;2014年03期

7 向峗;王剛;陳兆明;張銳;孫成波;;不同溫度條件下鰻弧菌和白斑綜合癥病毒對凡納濱對蝦的致病性[J];熱帶生物學(xué)報;2015年01期

8 向峗;王剛;楊紹文;陳兆明;孫成波;;不同溫度條件下溶壁微球菌和白斑綜合癥病毒對凡納濱對蝦的致病性[J];浙江海洋學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年04期

9 徐翊軒;戰(zhàn)文斌;邢婧;;溫度與脂多糖對櫛孔扇貝血細(xì)胞吞噬活力的影響[J];中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年06期

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1 胡曉鵬;支原體小GTP結(jié)合蛋白類似片段（SGLP）與宿主細(xì)胞Rac1和Stat3相互作用及其功能影響[D];華中科技大學(xué);2013年

2 白楠;改性酵母葡聚糖的制備及其作為免疫增強(qiáng)劑在兩種甲殼動物上的應(yīng)用[D];中國海洋大學(xué);2013年

3 胡曉鵬;支原體小GTP結(jié)合蛋白類似片段（SGLP）與宿主細(xì)胞Rac1和Stat3相互作用及其功能影響[D];華中科技大學(xué);2013年

4 黃海洪;凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）抗哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）感染的免疫應(yīng)答特征研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 劉家舉;對蝦餌料生物攜帶WSSV的風(fēng)險評估及紅肉河藍(lán)蛤?qū)Ψ布{濱對蝦抗病力的影響[D];中國海洋大學(xué);2013年

2 黃建華;WSSV部分基因序列分析及防控WSS免疫增強(qiáng)劑的篩選[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 向峗;環(huán)境因子和弧菌對白斑綜合癥病毒（WSSV）在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的影響[D];廣東海洋大學(xué);2014年

4 徐翊軒;溫度和脂多糖對櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血細(xì)胞免疫響應(yīng)的影響[D];中國海洋大學(xué);2014年

5 李文婷;常用消毒劑對白斑綜合癥病毒（WSSV）的作用及病毒在宿主的感染增殖[D];國家海洋局第三海洋研究所;2014年

本文編號：2626111