發(fā)布時(shí)間：2020-04-11 22:13

【摘要】：心臟發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,它受到一系列信號(hào)通路的嚴(yán)格調(diào)控。在此過(guò)程中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)通路在心臟發(fā)育中扮演著重要角色。BMP2(Bone Morphogenetic Protein 2)是TGF-β超家族中的一員,也是BMPs家族成員中研究得較為廣泛的一個(gè)基因,在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中有重要的調(diào)控作用。本研究以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物,研究BMP2基因在斑馬魚(yú)心臟發(fā)育過(guò)程中的作用。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,BMP2蛋白在不同物種間的進(jìn)化是保守的。我們首先分析了BMP2在斑馬魚(yú)中的時(shí)空表達(dá)模式,半定量PCR結(jié)果顯示,BMP2在斑馬魚(yú)早期發(fā)育不同階段及成年斑馬魚(yú)不同的組織器官中均有表達(dá),主要在胚胎發(fā)育的4h-12h表達(dá)較高,在腦、心臟、肝臟、鰓、鰭和生殖器官中也有表達(dá)。整體胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)也確定了斑馬魚(yú)BMP2基因在胚胎發(fā)育的表達(dá)模式。通過(guò)morpholinos反義核苷酸敲減技術(shù)研究抑制了BMP2基因的表達(dá)后對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育產(chǎn)生的影響。MO下調(diào)BMP2基因的表達(dá)后,斑馬魚(yú)的心臟發(fā)育顯示不同程度的異常表型,主要表現(xiàn)為:心臟不能正常環(huán)化、心包囊腫、微弱的血液循環(huán)、血液滯留、心跳減緩,部分畸形嚴(yán)重的在5天內(nèi)死亡。我們還發(fā)現(xiàn)MO下調(diào)BMP2基因的表達(dá)后,斑馬魚(yú)的死亡率和畸形率明顯高于對(duì)照組。把BMP2 MO和BMP2mRNA共注射進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示共注射的斑馬魚(yú)死亡率和畸形率都明顯下降,表明BMP2基因的mRNA能夠拯救morpholino反義寡核苷酸敲低BMP2基因表達(dá)所產(chǎn)生的異常。另外,通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)心臟標(biāo)記基因SMAD4、NKX2.5、CMLC2、MEF2C、TBX5、GATA4和HAND2進(jìn)行QRT-PCR分析,結(jié)果顯示MO抑制BMP2基因表達(dá)的胚胎中,標(biāo)記基因SMAD4、NKX2.5、CMLC2、MEF2C、TBX5、GATA4和HAND2的表達(dá)均受到不同程度的影響。這些結(jié)果表明斑馬魚(yú)BMP2基因通過(guò)調(diào)控心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來(lái)影響心臟發(fā)育。但BMP2具體是通過(guò)什么途徑影響斑馬魚(yú)的心臟發(fā)育,還需要更多的研究去闡明。
【圖文】：

2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AB 系斑馬魚(yú)。嚴(yán)格按照 zebrafish book 上的方法飼養(yǎng)斑馬魚(yú)。實(shí)驗(yàn)前一上將雄魚(yú):雌魚(yú)按 1:2 的比例放入交配缸里面，在第二天早上開(kāi)燈 15 min 后斑馬魚(yú)的卵。收集的受精卵用培養(yǎng)斑馬魚(yú)的水清洗兩次，再用自己配holtfreter 培養(yǎng)液在 28.5 ℃環(huán)境中培養(yǎng)。24 hpf 后用加入含 0.003%PTU 的培養(yǎng)可以抑制黑色素的產(chǎn)生，使胚胎透明，便于觀察。2.1.2 菌種大腸桿菌 E.coli DH 5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。2.1.3 載體pGEM-T easy 載體購(gòu)自 Promega 公司（圖 2-1）。

BMP2 基因在斑馬魚(yú)心臟發(fā)育過(guò)程中的功能研究3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1 BMP2 的同源性分析用 Clustal Omega 軟件分析斑馬魚(yú)、人和鼠的 BMP2 的蛋白保守序列，，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú) BMP2 編碼的蛋白與人及鼠的 BMP2 編碼的蛋白同源性非常高，說(shuō)明 BMP2 是一個(gè)高度保守的蛋白質(zhì)。這個(gè)結(jié)果也說(shuō)明利用斑馬魚(yú)作為模式生物研究 BMP2 在發(fā)育中的功能是完全可行的。三者的序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)（圖 3-1）。圖中“:”代表相似程度較高；“.”代表相似程度較低；“*”代表完全匹配。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳侃;王長(zhǎng)謙;;模式生物斑馬魚(yú)在心血管疾病研究中的應(yīng)用[J];自然雜志;2013年01期

2 龔丁旭;張浩;胡盛壽;;心臟發(fā)育過(guò)程中常見(jiàn)的相關(guān)基因與先天性心臟病[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2011年02期

本文編號(hào)：2623899