【摘要】：刺參作為滋補食品和藥膳飲食,深受人們的喜愛。然而,刺參在捕撈、運輸和加工過程中極易發(fā)生自溶,給相關(guān)行業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。前期研究表明,刺參內(nèi)源性蛋白酶參與其自溶過程。目前為止,國內(nèi)外對于刺參自溶酶的基因信息及結(jié)構(gòu)特征研究甚少�；跒閲鴥�(nèi)外學者在該領(lǐng)域的探索提供理論基礎(chǔ),本論文以刺參為研究對象,首次從刺參內(nèi)臟中克隆得到絲氨酸蛋白酶(serine proteinase,SP)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的基因序列,并利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)SP和MMP-2的體外表達,獲得有活性的重組蛋白酶,同時對其進行性質(zhì)分析。根據(jù)已獲得的刺參內(nèi)臟SP部分氨基酸序列設(shè)計特異性引物,利用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得其基因全長共1367 bp,包括44 bp 5’端非編碼區(qū)和192 bp 3’端非編碼區(qū)。其ORF為1131 bp,編碼377個氨基酸殘基,其中Asp138、His176和Ser325構(gòu)成SP的催化三聯(lián)體。刺參SP屬于Subtilisin家族絲氨酸蛋白酶,其三級結(jié)構(gòu)中含有6個平行的β折疊片,被兩側(cè)的α螺旋包圍,形成典型的“三明治”結(jié)構(gòu),此外,在SP的C端還有2個β折疊型結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)的正確折疊等過程。進一步利用大腸桿菌表達系統(tǒng)體外表達重組刺參SP,通過His Trap親和柱層析得到大量高度純化的重組刺參SP。利用重組刺參SP制備特異性多克隆抗體,進一步將具有良好效價和特異性的兔抗重組刺參SP特異性多克隆抗體與CNBr-activated Sepharose 4B親和柱偶聯(lián),制備親和層析柱純化得到一部分純度較高的天然SP。同時通過構(gòu)建重組質(zhì)粒p PIC9K-SP并轉(zhuǎn)入畢赤酵母中,利用甲醇誘導表達,獲得分子量為70 k Da的有活性的重組刺參SP。根據(jù)MMPs保守序列設(shè)計引物,首次擴增得到刺參MMP-2酶原的基因序列。刺參MMP-2酶原包括前肽結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域以及類血紅素結(jié)構(gòu)域。催化結(jié)構(gòu)域中包含3個相同的II型纖連蛋白,其和類血紅素結(jié)構(gòu)域在空間上都是較獨立完整的,類血紅素結(jié)構(gòu)域通過鉸鏈區(qū)與催化結(jié)構(gòu)域相連接。利用大腸桿菌表達刺參MMP-2催化結(jié)構(gòu)域,并通過His Trap親和柱層析純化得到分子量約為40 k Da的目的蛋白。通過稀釋復性,重組蛋白能夠進行正確折疊,首次獲得了大量有活性的重組刺參MMP-2。進一步利用明膠酶譜法對重組刺參MMP-2進行性質(zhì)研究,結(jié)果顯示重組刺參MMP-2在35°C~40°C活性最高,在p H 7.5~9.0條件下都具有一定的酶活性,最適p H為8.0。此外,適量的金屬離子Ca2+可以顯著激活重組刺參MMP-2的酶活性。以上結(jié)果表明重組刺參MMP-2是一種弱堿性蛋白酶,屬于鈣離子依賴型金屬蛋白酶,與天然MMP-2相似。
【學位授予單位】：集美大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【共引文獻】

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本文編號：2623827