【摘要】：MicroRNA(簡(jiǎn)稱miRNA)是一類進(jìn)化上高度保守的小分子非編碼RNA,長(zhǎng)度大約為22 nt,結(jié)合于靶基因的3’非翻譯區(qū)(UTR),具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)和翻譯的功能。miRNA在不同物種中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能,包括機(jī)體發(fā)育,神經(jīng)調(diào)控,細(xì)胞增殖與凋亡,脂肪生成與代謝和造血作用等,本研究的內(nèi)容主要集中于miRNA及其所涉及的生物學(xué)途徑在性腺分化和生殖細(xì)胞的發(fā)育等方面的作用。黃鱔(Monopterus albus)在發(fā)育的的過(guò)程中,具有由雌到雄的自然轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象。為了研究其性逆轉(zhuǎn)的生理機(jī)制,本研究利用深度測(cè)序的方法鑒定出性腺不同發(fā)育階段(雌性,間性和雄性)黃鱔腦、肝臟和性腺中160個(gè)成熟的miRNA,其中黃鱔Let-7家族、miR-10b、miR-143、miR-26a、miR-21、miR-181a和miR-9具有較高的表達(dá)量；48個(gè)miRNA在黃鱔性腺不同發(fā)育階段具有顯著的表達(dá)差異(P0.001),其中9個(gè)miRNA在兩兩之間超過(guò)8倍以上的表達(dá)差異,黃鱔miR-430家族成員均表現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異,預(yù)測(cè)了黃鱔miR-430的靶基因,通過(guò)Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析了黃鱔miR-430靶基因間的相互關(guān)系,主要涉及到生殖系統(tǒng)發(fā)育等一些生物學(xué)過(guò)程。為了深入研究miR-430家族在魚(yú)類性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的作用,我們選擇硬骨魚(yú)類性別決定與分化的研究的模式動(dòng)物—青溕(Oryzias latipes)作為一個(gè)比較研究的對(duì)象。檢測(cè)了青溕成魚(yú)雌雄間miR-430家族的表達(dá)量,雌雄間的表達(dá)量差異從腦、肝臟到性腺逐漸擴(kuò)大。再分別利用性激素17β-Estradiol和17β-Trenbolone對(duì)受精后5 d(5dpf)的胚胎進(jìn)行7d的暴露試驗(yàn),暴露后青溕miR-430b的表達(dá)量升高。同時(shí),預(yù)測(cè)了黃鱔和青溕miR-430家族與靶基因foxl2的調(diào)控關(guān)系,并用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示：黃鱔miR-430b結(jié)合于黃鱔foxl2基因的3'UTR區(qū)域。而青鏘中可能由于過(guò)短的foxl2 3'UTR,避免了一些miRNA對(duì)其的調(diào)控,如miR-430家族。因此我們推測(cè)黃鱔miR-430家族可能是通過(guò)調(diào)控foxl2的和其他性別決定基因的表達(dá)從而影響黃鱔的性逆轉(zhuǎn)。Forkhead基因家族進(jìn)化分析認(rèn)為,foxl2在許多硬骨魚(yú)類中存在不同的拷貝,分別為foxl2a (foxl2)和foxl2b (foxl3)。因此我們推測(cè)黃鱔中存在foxl3拷貝并通過(guò)RACE方法克隆得到黃鱔foxl3序列,foxl3基因開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)795bP,編碼264個(gè)氨基酸殘基。其中黃鱔Foxl3氨基酸序列與歐洲黑鱸(Dicentrarchus labrax)相似性最高,為82.9%。用最大似然法(ML)構(gòu)建了11個(gè)魚(yú)類Forkhead家族進(jìn)化發(fā)育樹(shù),Forkhead家族3個(gè)成員分別聚類為3個(gè)分支(Foxl1, Foxl2和Fox13),黃鱔Foxl3氨基酸序列與斑馬魚(yú)(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、青溕和歐洲黑鱸聚類為一支,與歐洲黑鱸親緣關(guān)系最近(bootstrap 89)。采用半定量和熒光定量PCR的方法分析了黃鱔foxl3基因的組織分布特征及在性腺中的表達(dá)差異,foxl3基因在黃鱔脾臟、腎臟、腦中表達(dá)量較高,血細(xì)胞和心臟中表達(dá)量較低；在黃鱔性腺發(fā)育的過(guò)程中foxl3的表達(dá)量逐漸增加,精巢中的表達(dá)量約為卵巢中的40倍,性腺中表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。在本研究中通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了黃鱔miR-9而不是miR-430a結(jié)合于靶基因foxl3 3'UTR區(qū)域,推測(cè)黃鱔foxl3基因轉(zhuǎn)錄后可能受到miR-9的調(diào)控,對(duì)Foxl3的調(diào)控可能是研究黃鱔性逆轉(zhuǎn)的一條新途徑。
【圖文】：

圖１．邋ｍｉＲＮＡ的生成與作用機(jī)制逡逑Ｆｉｇ邋１．邋ｍｉＲＮＡ邋ｂｉｏｓｙｉｕｈｅｓｉｓ邋ａｎｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ａｃｔｉｏｎ逡逑１．２邋ｍｉＲＮＡ在哺乳動(dòng)物性腺發(fā)育中的作用睪丸的生精、卵巢的生卵與內(nèi)分泌功能受下丘腦－垂體－性腺（睪丸或巧巢）軸

列（１５．５３％）邋｜＾Ｊｌ及個(gè)樣本間共有的ｍｉＲＮＡ個(gè)數(shù)（表３）。大部分的序列長(zhǎng)度介于２０逡逑到２３邋ｎｔ之間。２２邋ｎｔ的序列占有最高的百分比（如．６３％），雌性、間性和雄性分別占逡逑２１．６３％、１６．１４％和２２．８６％邋（圖６Ａ）。選擇Ｒｆａｍ數(shù)據(jù)庫(kù)注釋所有的�。遥危列蛄�，逡逑其中１５．２２Ｍ的�。遥危量捎成涞剑遥妫幔頂�(shù)據(jù)庫(kù)，含有８．８９Ｍ邋Ｇ６．２１％）的ｎｃＲＮＡｓ，逡逑包括邋ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ邋和邋ｓｎｏＲＮＡ邋（圖}）。已知的邋ｍｉＲＮＡ邋有邋ｔ巧邋Ｍ逡逑占２５．８０％，包括７５，４巧條唯一的序列；無(wú)法映射到Ｒｆａｍ數(shù)據(jù)庫(kù)的�。遥危翞椋梗常玻湾义希ǎ常罚梗罚ィ�。在己知的ｍｉＲＮＡ序列和未映射到Ｒｆａｍ的序列中，６．８４Ｍ邋（４３．７２％）序逡逑列完全匹配上斑馬魚(yú)基因組，，其中包括３６５，６５４邋（９．３０％）唯一的序列（圖７）。雌性，逡逑間性和雄性的黃

本文編號(hào)：2624040