【摘要】：真核生物翻譯延伸因子1A(Eukaryotic translation elongation factor 1,eEF1A)是真核細(xì)胞中分布最廣泛且含量最豐富的蛋白質(zhì)之一。eEF1A在真核生物的蛋白質(zhì)生物合成中扮演著最核心的角色。在肽鏈延伸的過程中,eEF1A結(jié)合GTP和氨酰tRNA形成eEF1A-GTP-tRNA三元復(fù)合物,攜帶氨酰化的tRNA至核糖體A位。當(dāng)mRNA上的密碼子和tRNA攜帶的反密碼子正確識別后,GTP在核糖體中被水解,eEF1A-GDP復(fù)合物也從核糖體中游離出來,參與下一輪的肽鏈延伸反應(yīng)。配子發(fā)生是一個高度復(fù)雜的遺傳物質(zhì)傳遞過程,期間難以計數(shù)的蛋白質(zhì)需要在性腺中合成。雖然eEF1A已被報道廣泛地表達于真核生物各個組織器官中,但其在性腺中的表達及其在配子發(fā)生中扮演的角色仍有待闡明。哺乳動物有2個eEF1A基因eEF1A1和eEF1A2,但僅有eEF1A1在雌雄性腺中表達。硬骨魚類具有5個eEF1A基因,且不同的eEF1A基因在不同組織中的表達。本實驗室前期在尼羅羅非魚中分離出一個在精巢中高表達的eEF1A1b,以及一個卵巢中特異表達的42Sp50。利用已有的42Sp50多克隆抗體和本研究制備的eEF1A1b多克隆抗體,通過Western blot和免疫組化分析了eEF1A1b和42Sp50在尼羅羅非魚不同發(fā)育階段性腺中的表達模式和細(xì)胞定位。通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成功突變eEF1A1b和42Sp50,并建立了突變系,分析了相應(yīng)突變體的配子發(fā)生的情況、基因表達以及血清雌雄激素的水平。具體研究結(jié)果如下:1)eEF1A1b在性腺發(fā)育過程中的表達模式和細(xì)胞定位。Western blot分析結(jié)果表明:在精巢中,eEF1A1b在孵化后90天(day after hatching,dah)開始呈現(xiàn)高表達,在120 dah時表達量達到最高,在300 dah表達量降低;在卵巢中,eEF1A1b的表達量始終很低。免疫組化分析表明,eEF1A1b特異地表達在精巢的精原細(xì)胞,以及卵巢的卵原細(xì)胞和I時相卵母細(xì)胞中。2)eEF1A1b在性腺中的功能研究分析。通過CRISPR/Cas9成功突變羅非魚eEF1A1b,并獲得了雜合突變魚,分析了F0代突變嵌合體和F1代雜合子雄魚的性腺表型,發(fā)現(xiàn)二者表現(xiàn)出基本相同的表型。eEF1A1b的雜合突變導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯、類固醇發(fā)生降低和精子形變異常,最終引發(fā)雄性不育。eEF1A1b~(+/-)雄魚的性腺成熟指數(shù)(GSI)顯著小于野生型雄魚。野生型雄魚的精巢在90 dah時已可觀察到精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精細(xì)胞的存在;在120 dah時含有各級生精細(xì)胞和少量的精子;在150和180 dah時已經(jīng)含有大量成熟的精子。然而,eEF1A1b~(+/-)精巢在90 dah時僅存在精原細(xì)胞,在120 dah開始出現(xiàn)少量精母細(xì)胞,在150和180 dah時eEF1A1b~(+/-)精巢中雖然具有各級生精細(xì)胞,但精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于野生型精巢。同時,eEF1A1b~(+/-)雄魚的血清雄激素11-KT水平顯著低于野生型雄魚。育性實驗表明,eEF1A1b~(+/-)雄魚的精子不具備受精能力。精子分析實驗發(fā)現(xiàn),相對于野生型雄魚的精子,eEF1A1b~(+/-)雄魚的精子濃度明顯降低,精子畸形率顯著上升,絕大多數(shù)eEF1A1b~(+/-)雄魚的精子呈現(xiàn)無尾或尾部縮短,精子運動能力極差,其前向運動能力以及游動速度都顯著低于野生型雄魚的精子。轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)合real time PCR驗證分析發(fā)現(xiàn),精子發(fā)生關(guān)鍵基因(例如:aspm、cdk16、suz12a和usp26)的表達水平在eEF1A1b~(+/-)精巢中顯著降低。這些基因與eEF1A1b一樣表達在精原細(xì)胞中,推測eEF1A1b突變可能導(dǎo)致精原細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯受阻,繼而引起精子發(fā)生阻滯。同時,精子鞭毛形成的關(guān)鍵基因(tuba1b、tuba3d和tuba8)表達紊亂,可能是導(dǎo)致eEF1A1b~(+/-)雄魚精子形變異常的主要原因。此外,類固醇發(fā)生相關(guān)基因(sf-1、cyp11a1、star和cyp11b2)在eEF1A1b~(+/-)精巢中的表達水平顯著降低,導(dǎo)致eEF1A1b~(+/-)雄魚的血清雄激素降低。然而,類固醇發(fā)生相關(guān)基因均表達在精巢的Leydig細(xì)胞中,而eEF1A1b僅表達于精原細(xì)胞,因此eEF1A1b突變對類固醇發(fā)生相關(guān)基因的影響應(yīng)該是一種間接影響,推測精原細(xì)胞中衍生的信號可能通過直接或間接途徑作用于Leydig細(xì)胞。過表達eEF1A1b成功回救eEF1A1b~(+/-)精巢精子發(fā)生阻滯的表型,表明精巢中產(chǎn)生的表型確實是由于eEF1A1b突變導(dǎo)致的。另一方面,雖然eEF1A1b在卵巢中有少量的表達,但eEF1A1b的突變并不影響雌魚的卵子發(fā)生和育性。3)42Sp50在性腺發(fā)育過程中的表達模式和細(xì)胞定位。Western blot分析結(jié)果表明:在卵巢中,42Sp50在30 dah時表達量較低,在60-90dah時呈現(xiàn)高表達,在180 dah時表達量降低;在精巢中,始終檢測不到42Sp50的表達。熒光免疫組化分析表明,42Sp50在60-180 dah的卵巢中均特異地表達在I、II時相的卵母細(xì)胞中,而在精巢中始終沒有檢測到42Sp50的免疫熒光。4)42Sp50在性腺中的功能研究分析。通過CRISPR/Cas9成功突變羅非魚42Sp50,并構(gòu)建了純合突變系,分析了F2代純合子的表型。研究發(fā)現(xiàn)缺失42Sp50導(dǎo)致濾泡形成障礙、卵母細(xì)胞滯育和類固醇發(fā)生抑制,最終引起雌性不育。在120dah時,42Sp50~(-/-)和野生型卵巢在解剖學(xué)和組織學(xué)水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異。42Sp50~(-/-)和野生型雌魚的GSI并無顯著差異,且兩者卵巢中均含有卵原細(xì)胞、I和II時相卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞計數(shù)分析表明,42Sp50~(-/-)與野生型卵巢中I和II時相卵母細(xì)胞的數(shù)量無顯著差異,證明缺失42Sp50并不影響卵巢減數(shù)分裂起始和卵母細(xì)胞的早期發(fā)育。在180 dah時,42Sp50~(-/-)卵巢明顯小于野生型卵巢,42Sp50~(-/-)雌魚的GSI顯著低于野生型雌魚。組織學(xué)分析結(jié)果表明,野生型卵巢中已經(jīng)出現(xiàn)III時相(卵母細(xì)胞中存在皮質(zhì)顆粒)和IV時相早期(卵母細(xì)胞中出現(xiàn)卵黃顆粒)卵母細(xì)胞,而42Sp50~(-/-)卵巢中仍只存在I和II時相的卵母細(xì)胞。DAPI染色結(jié)果表明,野生型的卵巢可檢測到在由柱狀顆粒細(xì)胞和梭型鞘膜細(xì)胞形成的成熟的雙層濾泡細(xì)胞,而在42Sp50~(-/-)卵巢中僅存在由扁平狀前體顆粒細(xì)胞構(gòu)成的單層濾泡細(xì)胞。Real-time PCR分析結(jié)果表明,42Sp50~(-/-)卵巢中卵母細(xì)胞生長標(biāo)記基因bmp15、gdf9、figla和zarI和濾泡細(xì)胞標(biāo)記基因amhr2的表達水平均顯著低于野生型卵巢。此外,42Sp50~(-/-)卵巢中類固醇合成酶基因(star2、cyp11a1、cyp17a1、cyp17a2和cyp19a1a)的表達量顯著下調(diào),且42Sp50~(-/-)雌魚的血清雌激素水平同樣顯著降低。對42Sp50~(-/-)卵巢的轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn),42Sp50~(-/-)卵巢中mTORC1信號通路活性嚴(yán)重受損。已有大量的研究表明mTORC1信號通路對濾泡的形成和卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。為了驗證是否是由于mTORC1信號通路的受損導(dǎo)致42Sp50~(-/-)雌魚卵泡發(fā)生阻滯和類固醇發(fā)生障礙,本研究利用mTORC1信號通路抑制劑Rapamycin對野生型雌魚進行處理并分析卵巢表型。結(jié)果顯示,Rapamycin處理基本復(fù)制了缺失42Sp50在卵巢所導(dǎo)致的表型。Rapamycin處理組雌魚的卵巢同樣表現(xiàn)為濾泡不能正常形成、卵母細(xì)胞滯育以及類固醇發(fā)生抑制的表型。結(jié)合42Sp50的功能缺失實驗和Rapamycin處理實驗,我們推測mTORC1信號通路活性受損可能是導(dǎo)致42Sp50~(-/-)卵巢濾泡發(fā)生障礙和卵母細(xì)胞滯育的主要原因之一,42Sp50可能負(fù)責(zé)mTORC1通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的合成,亦或是可能對mTORC1信號通路具有直接或間接的調(diào)控功能。另一方面,42Sp50并不表達于精巢中,因而缺失42Sp50并不影響雄魚的精子發(fā)生和育性。綜上所述,eEF1A1b和42Sp50分別是羅非魚雄性和雌性生殖細(xì)胞特異的eEF1A基因。我們在尼羅羅非魚中建立了eEF1A1b和42Sp50的突變系,發(fā)現(xiàn)eEF1A1b單倍劑量不足導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯,但不影響雌性卵子發(fā)生過程;而42Sp50缺失導(dǎo)致濾泡發(fā)生障礙,但不影響精子發(fā)生過程,表明在羅非魚中,翻譯延伸因子對配子發(fā)生不可或缺,但雌性和雄性的配子發(fā)生過程需要不同的eEF1A基因,eEF1A基因在雌性和雄性的配子發(fā)生中產(chǎn)生了功能分化。本研究豐富了對eEF1A基因在硬骨魚類,乃至在脊椎動物配子發(fā)生中功能的認(rèn)知。
【圖文】：

圖 1 哺乳動物和魚類精巢對比（引自 Hai et al., 2014; Yoshida, 2016）物曲細(xì)精管切面示意圖。B）魚類精小葉切面示意圖。Sg，精原細(xì)胞；Sc，精母細(xì)胞ES，長型精子細(xì)胞；Sp，精子；SE，支持細(xì)胞；PMC/MY，類肌樣細(xì)胞；BL，基底膜； Comparison of mammalian and fish testis (Cited from Hai et al., 2014; Yosalian spermatogenesis takes place in the germinal epithelium of the seminiferous tubules ofatogenesis takes place in the spermatogenic cyst; Sg, spermatogenesis; Sc, spermatocy ES, elongating spermatids; PMC, peritubular myoid cell; LC, Leydig cells; BL, basal lamin發(fā)生發(fā)生即是由二倍型的精原細(xì)胞經(jīng)過增殖和分化，，最終形成單倍，該過程高度復(fù)雜，卻又具有高度的組織性和協(xié)調(diào)性。精子發(fā)中是非常保守的，可以概括分為三個階段：精原細(xì)胞有絲分裂代的精原細(xì)胞的產(chǎn)生）、減數(shù)分裂階段（伴隨初級精母細(xì)胞和次）和精子形成期（伴隨單倍型的精子細(xì)胞出現(xiàn)，最終形成具有

物和魚類卵子發(fā)生示意圖 （引自 Edson et al., 2009; Lubzens eenesis of mammal and fish (Cited from Viran et al., 2009; Lubzeof the major stages of mammalian folliculogenesis. B) Developmental sequen the postvitellogenicphase showing the sequence of chromosomal changes.相關(guān)蛋白同樣是一個高度復(fù)雜的過程，卵母細(xì)胞的形成、發(fā)育到包括內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌和鄰分泌因素的影響的研究指出，卵母細(xì)胞的發(fā)育過程及其調(diào)控主要受垂體 LH 控制（Baird et al., 1981; Danforth, 1995; Hillier, 200技術(shù)手段的快速發(fā)展和學(xué)者們對卵巢研究的深入，已胞和體細(xì)胞中合成和分泌的許多蛋白因子對卵巢的發(fā)介導(dǎo)和調(diào)控促性腺激素活性的功能。這些由卵巢自身個嚴(yán)密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在卵母細(xì)胞形成、發(fā)育與成熟以方面扮演著重要的角色（Ge, 2005; Liu et al., 2006）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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本文編號：2620424