【摘要】：體色對(duì)于養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)至關(guān)重要,是評(píng)估其商品價(jià)值的重要指標(biāo)。對(duì)于觀賞型魚(yú)類(lèi),體色鮮艷可以升高其商品價(jià)值,而對(duì)于食用型魚(yú)類(lèi),體色出現(xiàn)異常的商品魚(yú)會(huì)造成價(jià)值的減少。早前研究魚(yú)類(lèi)體色方法主要以觀察表型和雜交等傳統(tǒng)遺傳學(xué)手段為主,自高通量測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)之后,針對(duì)魚(yú)類(lèi)體色的研究,已經(jīng)從發(fā)育和分子遺傳角度得到了一些初步結(jié)果。而我國(guó)魚(yú)類(lèi)體色研究多集中在一些體色豐富的品種,如錦鯉、甌江彩鯉等,針對(duì)黃河鯉以及鱘魚(yú)的體色遺傳機(jī)制研究幾乎為空白。在本研究中我們分別從全基因組和轉(zhuǎn)錄組層面對(duì)兩種魚(yú)類(lèi)差異體色樣本進(jìn)行研究,在生物信息學(xué)基礎(chǔ)上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以Plink、Popoolation2、BWA、SAMtools、Trinity和Blast等主要軟件處理數(shù)據(jù)并得到色素合成相關(guān)基因。在黃河鯉體色研究中以基因組數(shù)據(jù)分析手段為基礎(chǔ),先對(duì)黃河鯉家系F1代子代中的紅色和黑色個(gè)體使用鯉魚(yú)高通量SNP分型芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS),掃描得到的SNP位點(diǎn)使用Plink軟件的logistic回歸模型和Bonferronit統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法尋找其中的差異顯著性位點(diǎn),得到總計(jì)34,124個(gè)SNP位點(diǎn),定位到參考基因組找到189個(gè)功能基因,但沒(méi)有明顯和色素合成相關(guān)的基因。因而采用BSA方法,借助高通量測(cè)序進(jìn)一步對(duì)F2子代中的紅色和黑色個(gè)體混合池進(jìn)行分析。經(jīng)測(cè)序并清洗數(shù)據(jù)后得到總計(jì)610,997,044條讀數(shù)(read),比對(duì)到鯉魚(yú)參考基因組,比對(duì)率最低也達(dá)到95%。比對(duì)結(jié)果使用Popoolation2進(jìn)行同步化處理并計(jì)算等位基因頻率差異,再經(jīng)過(guò)費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn),最終篩選出極顯著位點(diǎn)(-logP值大于8)15,016個(gè),定位到513個(gè)功能基因,經(jīng)過(guò)檢索找到五個(gè)和黑色素合成相關(guān)基因,其中三個(gè)基因分別是:MITF負(fù)責(zé)啟動(dòng)酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄;CREB1負(fù)責(zé)啟動(dòng)MITF的轉(zhuǎn)錄;ASIP抑制真黑色素并促進(jìn)褐黑色素的形成,另外兩個(gè)基因表達(dá)細(xì)胞膜上蛋白GNAS和OCA2,前者與MC1R偶聯(lián)后激活CREB1和MITF開(kāi)啟酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄,后者輔助黑色素合成底物進(jìn)入黑素小體。本研究提示黃河鯉紅色群體與黑色群體相比其真黑色素合成過(guò)程可能被抑制,色素合成以褐黑色素為主。在第二部分中我們對(duì)正常黑色表型和白化表型的俄羅斯鱘進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析。通過(guò)對(duì)這兩群體以及混合之后總共三個(gè)樣本的測(cè)序,獲得了總計(jì)277,268個(gè)contig作為參考轉(zhuǎn)錄組序列,并將組裝序列與3個(gè)主要蛋白庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并注釋,得到32,965個(gè)基因。在對(duì)這兩群體分析差異基因表達(dá)時(shí),總共發(fā)現(xiàn)785個(gè)基因表達(dá)顯著不同。在正常黑色群體中有400個(gè)基因上調(diào),在白化群體中有385個(gè)基因上調(diào),之后我們隨機(jī)選出16個(gè)基因進(jìn)行定量RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量一致�；蚬δ茴�(lèi)別(GO)注釋中17,058個(gè)基因得到注釋,包括所有差異基因;在GO富集分析中有35個(gè)與色素合成相關(guān)基因顯著富集;KEGG通路分析中差異基因匹配的148條通路中有3條與黑色素合成相關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)檢索和本研究的數(shù)據(jù),我們鎖定了包括Dct、Tyrp1、SLC45A2、MC1R、CNTS、PMEla、PMElb、CD63和BLOC1S3在內(nèi)的9個(gè)基因。在這些基因的表達(dá)產(chǎn)物中,3個(gè)基因表達(dá)以酪氨酸為底物催化成真黑色素過(guò)程的關(guān)鍵酶,2個(gè)基因調(diào)節(jié)黑素小體的pH值,3個(gè)基因參與黑素小體的形成,1個(gè)基因表達(dá)負(fù)責(zé)運(yùn)輸黑色素合成所需酶。本研究結(jié)果提示白化俄羅斯鱘與正常鱘魚(yú)相比可能存在黑色素和黑素小體的缺陷。我們通過(guò)以上分析為其黃河鯉以及俄羅斯鱘體色變異的進(jìn)化和遺傳學(xué)研究提供基因組證據(jù),以及為這兩種魚(yú)類(lèi)的品種選育提供分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。
【圖文】：

12圖 2-1 黃河鯉黑、紅兩色群體全基因組關(guān)聯(lián) SNP 分型曼哈頓圖Fig.2-1 Manhattan plot of genome-wide association SNP genotyping2.2 BSA 分析結(jié)果2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果測(cè)序數(shù)據(jù)與鯉魚(yú)參考基因組數(shù)據(jù)比對(duì)，選用 BWA 中的 mem 參數(shù)，，即將70bp-1Mbp 的序列通過(guò) BWA-MEM 算法比對(duì)到基因組，這種算法通過(guò)最大精確比對(duì)（MEMs）法進(jìn)行種子比對(duì)，再經(jīng)過(guò) Smith-Waterman 算法對(duì)種子進(jìn)行擴(kuò)增。相較于

上海海洋大學(xué)碩士(博士)學(xué)位論文250,459 個(gè)顯著差異的 SNP，曼哈頓圖結(jié)果顯示 11 號(hào) 12 號(hào)染色體上差異 SNP 位點(diǎn)顯著高于其他染色體(圖 2-3)。在篩選-log P 值大于等于 8 的 SNP 位點(diǎn)中總共得到 15,016 個(gè) SNP，定位到參考基因組的 513 個(gè)基因。在 KEGG mapper 搜索通路結(jié)果中顯示有 5 個(gè)基因與黑色素合成相關(guān)，分別是 MITF、CREB1、ASIP、GNAS、和 P蛋白（OCA2）。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2614750