【摘要】：我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)體量巨大,給人們提供了大量的優(yōu)質(zhì)蛋白,是我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。病毒病是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染性疾病,傳統(tǒng)的治療手段無(wú)法有效的殺滅魚體的病毒和控制其傳播。腸道菌群如今已被證實(shí)參與機(jī)體和病毒互作,調(diào)控機(jī)體抗病毒免疫,與此相應(yīng)的,部分研究表明益生菌可有效控制水生病毒對(duì)養(yǎng)殖魚類的感染和傳播。我們首先分析了同一發(fā)病魚塘中感染和不感染鯉魚皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的鯉魚(Cyprinus carpio)的腸道菌群,發(fā)現(xiàn)發(fā)病鯉魚腸道腸桿菌和假單胞菌的豐度與正常鯉魚有著明顯差異,但整體的菌群結(jié)構(gòu)未見顯著性區(qū)別。之后我們分析了對(duì)CyHV-2有不同抗性的兩種異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的腸道菌群,發(fā)現(xiàn)兩種異育銀鯽品系的腸道菌群結(jié)構(gòu)高度相似,二者只是在個(gè)別低豐度的屬種出現(xiàn)顯著性的差異。為了進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)室可控的條件下研究腸道菌群對(duì)魚類病毒感染的可能影響,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室條件下,成功模擬了鯉魚春季病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)的自然傳播途徑,建立了基于成年斑馬魚的病毒感染模型。通過(guò)給3月齡正常成年斑馬魚腹腔注射10~8 copies的SVCV,在其發(fā)病后與正常1月齡斑馬魚共浴,使1月齡斑馬魚感染SVCV。并且檢測(cè)了共浴魚中高帶毒魚體和不帶毒(或帶毒量極低)魚體腸道菌群及抗病毒相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示不帶毒魚體中抗病毒免疫相關(guān)基因Rig-I、MxB、pkz、IFN phi1、IFN phi2的表達(dá)量均顯著高于高帶毒魚體,說(shuō)明不帶毒魚體的天然抗病毒免疫反應(yīng)高于高帶毒魚。然而,不帶毒魚體和高帶毒魚體的腸道細(xì)菌數(shù)量和主要門和屬的豐度無(wú)顯著性差異。最后,我們采用了無(wú)菌斑馬魚生產(chǎn)技術(shù),建立了無(wú)菌斑馬魚病毒浸浴感染模型。使用約10~8copies/mL SVCV浸浴感染無(wú)菌斑馬魚。浸浴攻毒后斑馬魚在第3日出現(xiàn)死亡,7日內(nèi)為死亡高峰期,最大死亡率在40-70%之間。我們使用該模型初步探究了斑馬魚腸道菌群和幾株代表性的腸道菌株對(duì)病毒感染的影響。結(jié)果顯示該感染模型穩(wěn)定可靠,在24 h菌魚互作周期下未觀察到腸道菌群和代表菌株對(duì)病毒感染的影響。72 h周期下觀察到鯨桿菌(Cetobacterium)和類志賀鄰單胞菌(Plesimonas shigelloides)顯著地降低了斑馬魚幼魚在浸浴病毒后的死亡率。本研究表明在野外條件下染毒程度不同的鯉魚和不同異育銀鯽品系健康狀態(tài)下腸道菌群未呈現(xiàn)顯著差異,進(jìn)一步我們?cè)趯?shí)驗(yàn)條件下構(gòu)建了共浴感染模型和無(wú)菌斑馬魚感染模型,為下一步研究菌群對(duì)魚類宿主病毒感染的影響以及快速篩選益生菌株(抗病毒感染)提供了支撐。
【圖文】：

13A：病魚鰓；B：正常魚鰓；C：病魚頭部；D：正常魚頭部；E：病魚內(nèi)臟；F：正常魚內(nèi)臟圖 2.1 病魚流行病學(xué)特征Fig 2.1 Epidemiological characteristics of diseased fish2.4.2 病毒測(cè)序鑒定使用 CyHV-2 的 DNA 聚合酶基因引物來(lái)擴(kuò)增病魚腎臟組織提取的 DNA 后，產(chǎn)物大小為362bp，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與 NCBI 中 CyHV-2 序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖 2.2。與 CyHV-2 的日本分離株相比，本次提取的病毒 DNA 擴(kuò)增出的 DNA 聚合酶基因序列有兩個(gè)堿基的突變，可以認(rèn)為是

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 養(yǎng)殖魚塘感染病毒的鯉魚腸道菌群分析同一種病毒。2.4.3 PCoA 主坐標(biāo)分析結(jié)果使用 PCoaA 主坐標(biāo)分析的方法，得到三種鯉魚菌群差異的 PCOA 圖，，如圖 2.3。圖中三種樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成越相似。圖上三種的鯉魚腸道樣本分散程度較大且無(wú)明顯差異。說(shuō)明腸道菌群組成無(wú)顯著差異。2.4.4 LEfSe 分析對(duì)三種魚進(jìn)行 LEfSe 分析，結(jié)果如圖 2.4。統(tǒng)計(jì)發(fā)病魚塘的未發(fā)病魚和發(fā)病后存活魚兩個(gè)組別當(dāng)中有顯著作用的微生物類群通過(guò) LDA 分析（線性回歸分析）后獲得的 LDA 分值，如圖 2.5。結(jié)果顯示，發(fā)病魚塘的未發(fā)病魚和發(fā)病后存活魚在腸桿菌科（Enterobacteriaceae）豐度上有顯著差異，發(fā)病魚體內(nèi)其豐度均為 2.99%，未發(fā)病魚則均為 1.99%。兩者在假單胞菌屬（Pseudomonas）豐度上有顯著差異，發(fā)病魚體內(nèi)豐度均為 0.29%，未發(fā)病魚則均為 1.73%。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S941.41

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