【摘要】：益生菌具有促進水產動物生長及免疫力等優(yōu)點被廣泛應用于水產動物養(yǎng)殖。蝦醬是由蝦體及蝦體內外微生物發(fā)酵而成,其中存在乳酸桿菌(Lactobacillus)、酵母菌(yeast)和芽孢桿菌(bacillus)等多種益生菌。目前,尚未見從蝦醬中篩選出益生菌應用于斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖的報道。本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作的蝦醬為材料,通過平板劃線分離法,從中分離具有強產酶能力和強拮抗能力的潛在益生菌,然后通過拌料投喂,研究篩選的益生菌對斑節(jié)對蝦的生長、消化酶活性、非特異免疫力以及對水質的影響。(1)本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作的蝦醬為材料,通過分離純化、溶血活性、產酶活性和拮抗活性檢測從蝦醬中分離微生物,結果如下:從海南省定安城生產的幫輝海蝦調味醬蝦醬和海口市本地產的蝦醬中,利用BCP培養(yǎng)基,從兩種蝦醬中共分離到產酸的菌株306株。通過溶血活性測定發(fā)現(xiàn),在306株產酸菌株中有36株為Y溶血,占總數(shù)的11.8%。測定上述36株菌的產酶活性,包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性,并測定其拮抗能力,病原菌為海水水產致病菌包括哈維氏弧菌(Vibrio Harveyi)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和淡水水產致病菌包括嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)及無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)。結果發(fā)現(xiàn),選出的36株γ溶血的待選益生菌的淀粉酶和蛋白酶的活性比較高,其中A27、A35、B47為高產酶菌株,產蛋白酶和淀粉酶的活性與其他菌株具有顯著差異(P0.05) ; A20酶活和拮抗能力強,其產淀粉酶的活性與其他菌株具有顯著差異(P0.05)且對4種致病菌的拮抗能力顯著高于其它菌株(P0.05) ; B3是強拮抗能力菌株,對實驗所選的5種致病菌均有拮抗能力,且對其中的4種致病菌的拮抗能力顯著高于其它菌株(P0.05) ; A11、B15和B89具有酶活和拮抗能力,至少對1種致病菌的拮抗能力顯著高于其它菌株(P0.05)。通過16SrRNA分子鑒定此8株菌均為芽孢桿菌屬。(2)通過耐酸、耐膽鹽、耐人工胃腸液和粘附能力及藥敏實驗對上述分離獲得8株芽孢桿菌進行檢測,結果發(fā)現(xiàn):芽孢桿菌A11、A20、A27、B47和B89的耐受能力強,A20和A27在強酸作用60 min和120 min的遲滯時間(LT)都具有顯著性差異(P0.05);在膽鹽濃度為0.1%、0.3%和0.5%時,A20的LT都具有顯著性差異(P0.05);當人工胃液作用時間為3h時,A20和A27與其他菌株具有顯著性差異(P 0.05);當人工腸液作用時間為4 h時,A27與其他菌株具有顯著性差異(P 0.05)。而在粘附性實驗中,A20和A27各個時間段的自凝率都高,24h的自凝集率達到了 98%及以上,顯著高于其他菌株(P0.05),A20和A27對所選的5種水產致病菌的共凝集率均有顯著差異(P0.05),且共凝集率達70%以上;在抗生素的耐藥性實驗中,A20和A27的敏感率是最高的。(3)將篩選出的芽孢桿菌A20和A27按照2.5 × 108CFU/g飼料的濃度拌料投喂斑節(jié)對蝦,檢測兩株芽孢桿菌對斑節(jié)對蝦生長、非特異免疫力和消化酶活性的影響,結果顯示飼養(yǎng)斑節(jié)對蝦6周后實驗組A20和A27組優(yōu)于對照組,各項指標如下:①斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖實驗的第2至6周,水體中化學需氧量(COD)、氨氮和亞硝酸鹽的濃度,投喂芽孢桿菌的A20組和A27組都顯著低于對照組(P0.05),且A27組與對照組有極顯著差異(P 0.01)�？傮w來說水體中有害物質的含量,實驗組比對照組少,且A27組凈化水質的作用最明顯;②生長性能的測定中,實驗組A20組和A27組的體長、體重、肥滿度、增重率和特定生長率都高于對照組,其中A20組的體重極顯著高于對照組(P 0.01)且增重率和特定生長率顯著差高于對照組(P 0.05),A20組的生長性能高于A27組;③非特異免疫指標中,超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(POD),添加芽孢桿菌的A20組和A27組都顯著高于對照組(P 0.05),A20組和A27組的酸性磷酸酶(ACP)都極顯著高于對照組(P0.01),A20組的溶菌酶(LSZ)顯著高于對照組(P0.05),且A20組的非特異性指標高于A27組;④消化酶活性的測定中,添加芽孢桿菌的A20組和A27組的胰蛋白酶及淀粉酶均極顯著高于對照組(P 0.01)。從蝦醬篩選出的γ溶血菌株,且產酸、酶活和拮抗能力強,及具有耐受性、粘附性和對抗生素敏感的芽孢桿菌A20和A27,在一定程度上提高了實驗斑節(jié)對蝦的消化酶活性和非特異免疫力,促進斑節(jié)對蝦生長,并具有改善水質的作用,芽孢桿菌A20在促進斑節(jié)對蝦的生長、非特異免疫力和消化酶活性方面較好;芽孢桿菌A27在改善水質方面更具有優(yōu)勢。
【圖文】：

．圖２－１八株潛在益生菌的系統(tǒng)進化樹逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ｅｉｇｈｔ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ逡逑１８逡逑

邐Ｂ１５邐Ｂ４７邐Ｂ８９逡逑菌株逡逑圖３－２八株芽孢桿菌在人工腸液的存活率，ａｂｅｄ表示每個時間段中存活率的顯著性水平逡逑（／＞＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｆｏｒ邋ｅｉｇｈｔ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｓｐｐ．邋ｉｎ邋ｓｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｆｌｕｉｄ，，邋ａｂｅｄ邋ｉｓ逡逑ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｒａｔｅ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｔｉｍｅ邋ｐｅｒｉｏｄ邋（Ｐ＜邋０．０５）．逡逑３．邋３．邋３粘附性的測定逡逑（１）自凝集逡逑自凝集率見圖３－３，由圖可知Ａ２０和Ａ２７各個時間段的自凝集效果都比較好，逡逑２４邋ｈ的自凝集率達到了邋９８％及以上；Ａｌｌ在前４邋ｈ內的自凝集率的增長率最快，逡逑２４ｈ達到了邋９０％；邋Ａ３５、Ｂ３、Ｂ１５和Ｂ８９的自凝集率在２、４和２４ｈ時都一般，逡逑最后達到７０％左右
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S968.22

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本文編號：2612495