【摘要】：七彩神仙魚(Symphysodon haraldi)為原生于南美洲亞馬遜河流域的熱帶觀賞魚,素有“熱帶魚之王”的美稱。盡管至今七彩神仙魚的養(yǎng)殖技術(shù)早已普及,但因為其早期性別區(qū)分困難,不易從外型上進行雌雄辨別,該魚的繁殖依舊是通過自然配對、自然產(chǎn)卵的方式進行的。這種人工模擬的繁殖方式,需要較久時間的配對,拉長了繁殖周期;再者,該魚產(chǎn)卵量少,且其人工催產(chǎn)技術(shù)也尚未能突破,這些因素都極大地制約苗種的生產(chǎn),限制了七彩神仙魚的規(guī)�；B(yǎng)殖。因此,為了促進七彩神仙魚的人工繁殖和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,對七彩神仙魚的性腺分化時間、發(fā)育規(guī)律進行深入研究非常有必要。掌握七彩神仙魚卵巢和精巢的相關(guān)生物信息將有助于我們研究雌雄辨別方法、加快人工催產(chǎn)的進程,從而進一步的控制七彩神仙魚繁殖的速度和質(zhì)量。本研究運用下一代高通量測序技術(shù)對七彩神仙魚性成熟時期的精巢和卵巢組織進行轉(zhuǎn)錄組測序,經(jīng)過對高質(zhì)量序列重頭組裝、拼接和功能基因注釋,發(fā)掘了與性別決定、生殖細胞發(fā)育等重要生命進程相關(guān)的候選基因,為后續(xù)功能基因的研究、篩選細胞分子標記及早期性別分化提供重要參考;利用RACE技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證并克隆七彩神仙魚vasa的cDNA全長,用Q-PCR技術(shù)對vasa基因在七彩神仙魚胚胎各個時期和早期發(fā)育階段進行了表達分析;根據(jù)獲得的vasa基因的cDNA序列設(shè)計熒光探針,以此標記PGCs,對七彩神仙魚仔魚階段的石蠟切片進行原位雜交,定位PGCs并觀察其分化過程,確定其分化時間。主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.七彩神仙魚性腺轉(zhuǎn)錄組分析采用Illumina Hiseq測序平臺4000完成七彩神仙魚成熟期精巢和卵巢組織1個混合樣的轉(zhuǎn)錄組測序。經(jīng)過對46,438,930條高質(zhì)量序列從頭組裝得到115,050個轉(zhuǎn)錄本和97,074個非冗余基因。將拼接得到的序列與Pfam、Swissprot和String等公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對,Nr庫中比對到序列最多的物種是尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus);GO數(shù)據(jù)庫注釋了大量的功能基因并進行了分類,提供了與性別決定、性腺分化、性激素調(diào)控等過程相關(guān)的候選基因,如vasa、sox9和foxl2;KEGG注釋結(jié)果提供了豐富的通路信息,如卵母細胞減數(shù)分裂通路。另外,從七彩神仙魚性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識別出26,083個SSR和10,571個SNP候選標記,為分子標記的開發(fā)提供了重要信息資源。2.七彩神仙魚vasa基因cDNA的克隆vasa基因是PGCs的第一個分子標記,同時也是生殖細胞的特異性分子標記。本研究利用RACE技術(shù)得到七彩神仙魚vasa基因cDNA序列,全長2,370bp,ORF編碼655個氨基酸,長1,968bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙魚的vasa cDNA與尼羅羅非魚的同源性最高。半定量分析表明,vasa基因在成熟七彩神仙魚的性腺中特異表達,在其他組織中無表達信號。Q-PCR結(jié)果顯示,vasa在七彩神仙魚早期胚胎發(fā)育階段及50日齡內(nèi)均有表達。在受精卵至囊胚期階段,vasa mRNA表達持續(xù)增加,在囊胚期至孵化期階段,表達持續(xù)降低。在仔魚階段,vasa分別在25日齡和40日齡出現(xiàn)了最低和最高表達量。繁殖前后比較發(fā)現(xiàn),繁殖前的精巢組織中vasa表達量比繁殖后的表達量低,而卵巢恰好相反。這些研究結(jié)果將為研究七彩神仙魚的原始生殖細胞定位、生殖細胞分子標記及其性腺分化提供參考。3.七彩神仙魚早期性別分化本研究根據(jù)1-70日齡石蠟切片HE染色、熒光原位雜交結(jié)果和實驗室前期工作確定了七彩神仙魚性別分化時間。結(jié)果表明,七彩神仙魚雌魚分化時間約為30-40日齡;雄魚的分化時間約為50-70日齡;雌性比雄性分化早。另外,七彩神仙魚為雌雄異體分化類型,不存在雌雄同體或性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。確定其性別分化時間不僅能幫助研究魚類性別分化和調(diào)控機制,還可以為人工性別控制、單性育種提供參考,為人工催產(chǎn)和提高養(yǎng)殖效率給予理論支持。
【圖文】：

Table.1-1 The PGCs origin of different fishes起源 科 種名內(nèi)胚層 舌鰨科 半滑舌鰨[32]Cynogloss semilaevis鯉科 泰山螭霖魚[33]Varicorhinus macrolep胡子鯰科 革胡子鯰[34]Lepisosteus oculatus異溕科 青溕[35]Oryzias latipes雀鱔科 雀鱔[35]Lepisosteus oculatus中胚層 石鱸科 大斑石鱸[35]Pomadasys maculatus七鰓鰻科 普氏七鰓鰻[35]Lampetra japonica石首魚科 大黃魚[35]Larimichthys crocea黃多核體的表胚層 鯉科 紅眼魚[35]Scardinius erythrophthalmus中、內(nèi)胚層之下表胚層之上 棘臀魚科 大口黑鱸[36]Micropterus salmonides體細胞分化 鯉科 斑馬魚[37]Danio rerio

技術(shù)路線
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2611916