【摘要】：草魚(Ctenopharyngodon idella)具有快速生長,肉質(zhì)肥嫩鮮美,肌間刺少等優(yōu)點,在中國作為主要的淡水魚養(yǎng)殖種類之一。在實際養(yǎng)殖過程中,因水體中的溶解氧濃度變動大,極易造成魚類缺氧泛塘,給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失,而目前對于低氧對魚類成體應(yīng)急反應(yīng)分子機制方面的研究還十分有限。鰓作為魚類的主要呼吸器官,在參與新陳代謝和滲透調(diào)節(jié)方面具有重要的功能,同時也是對低氧環(huán)境最為敏感的器官,低氧脅迫后鰓中很多功能基因表達會發(fā)生改變。多倍體育種技術(shù)屬于染色體組工程(Genome engineering)的研究領(lǐng)域,四倍體草魚不僅可以自我繁殖,還能夠與二倍體草魚雜交,快速、高效的獲得三倍體草魚,三倍體草魚在生長速度、抗逆性以及群體產(chǎn)量等方面均具有明顯的優(yōu)勢,這為魚類遺傳育種的研究開創(chuàng)了一種新型方法。本論文具體包括以下三方面:(一)為建立并優(yōu)化草魚鰓蛋白質(zhì)組雙向電泳的技術(shù)體系,實驗將草魚鰓經(jīng)裂解處理后,通過固相pH梯度膠條進行一向等電聚焦和SDS聚丙烯胺凝膠垂直電泳進行蛋白分離,對不同的裂解液配方、蛋白純化方法、IPG膠條的分離范圍、上樣量和染色方法等進行了探索和優(yōu)化,并應(yīng)用lmageMaster2D Platinum7.0軟件對電泳圖譜進行了分析。結(jié)果表明:采用裂解液中添加DTT來取代Tris和TBP、選擇分離范圍為pH4-7的IPG膠條和150μg的主動水化上樣,電泳結(jié)束后對凝膠進行硝酸銀染色,獲得了覆蓋范圍廣、低背景、高分辨率、適合差異蛋白分析的雙向電泳參考圖譜。本研究為后續(xù)進行草魚低氧脅迫下鰓的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支持。(二)為探索草魚鰓應(yīng)答低氧脅迫的適應(yīng)性及分子機制,并尋找起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)信息;本研究測定了草魚的LOE并且觀察了鰓組織結(jié)構(gòu)變化,采用雙向電泳(2-DE)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)對草魚鰓組織在低氧脅迫下差異蛋白質(zhì)進行鑒定和功能分析研究。電泳圖譜經(jīng)lmageMaster2D Platinum7.0軟件分析,低氧脅迫組獲得了372±11個蛋白點,對照組獲得了406±14個蛋白點,從中篩選出15個經(jīng)低氧脅迫后,表達量呈顯著變化的蛋白點。對15個差異蛋白點進行質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫搜索比對。結(jié)果顯示:低氧脅迫后,草魚鰓組織中的Toll樣受體4、環(huán)氧化物水解酶1、異檸檬酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、GTP結(jié)合核蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白表達顯著上調(diào),而角蛋白Ⅱ型細胞骨架8、細胞角蛋白I型、肌動蛋白相關(guān)蛋白3同源物、甲狀腺激素受體TRαA、線粒體ATP合酶β亞基、檸檬酸合酶、原肌球蛋白2、原肌球蛋白3蛋白表達顯著下調(diào)。其中發(fā)現(xiàn)6個蛋白質(zhì)在低氧誘導(dǎo)因子1信號通路中存在。結(jié)果表明草魚鰓組織在應(yīng)答低氧脅迫時涉及到能量產(chǎn)生、代謝、細胞結(jié)構(gòu)、抗氧化、免疫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程,這有助于了解魚類在應(yīng)對低氧脅迫時在蛋白質(zhì)水平的分子反應(yīng)機制。(三)為確認熱休克誘導(dǎo)草魚四倍體實際生產(chǎn)的可行性,本研究在實驗室探索出的誘導(dǎo)草魚四倍體胚胎孵化期存活率相對較高的熱休克條件基礎(chǔ)上對受精卵進行處理,具體方法如下:孵化溫度21±1℃時,胚胎受精后40min、42min、51min時,分別采用41°C和42°C的熱休克溫度處理2min。孵出的魚苗放入大塘養(yǎng)殖,冬季時對熱休克誘導(dǎo)的草魚進行倍性檢測分析其DNA相對含量。結(jié)果表明,熱休克誘導(dǎo)只獲得二倍體和三倍體草魚,沒有得到四倍體草魚,三倍體草魚DNA相對含量約為正常二倍體草魚DNA相對含量的1.5倍多。本研究采用熱休克法誘導(dǎo)處理草魚受精卵,可以獲得一定比例的三倍體草魚,但總體比例不高,并且四倍體草魚至今仍無法獲得,可以看出熱休克的方法對于草魚四倍體的實際生產(chǎn)操作技術(shù)難度大,后續(xù)在進行草魚多倍體育種研究時可以探尋新的方案,嘗試其他多倍體育種的方法。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文有效的蛋白純化方法可以顯著提高雙向電泳圖譜的質(zhì)量，本實驗使用上述優(yōu)化所得的裂解液配方Ⅱ，，對丙酮沉淀法和2D clean-up試劑盒法二種純化方式對雙向電泳圖譜的影響進行比較。從圖2-1-a中可以看出，丙酮法純化蛋白質(zhì)所得的雙向電泳圖譜在偏中性區(qū)域內(nèi)存在一定的蛋白質(zhì)丟失且橫條紋稍多，蛋白點較少。利用ImageMaster2D Platinum軟件分析圖像可獲得286個蛋白點。2D clean-up試劑盒法純化蛋白質(zhì)所得的雙向電泳圖譜上（圖2-1-b），蛋白點覆蓋范圍廣且分辨率高，在酸性端和中性端的蛋白點數(shù)量均有所增加，利用軟件分析獲得了418個蛋白點，相比于丙酮法增加了132個蛋白點，蛋白點分離明顯且恢復(fù)量較大。

有效的蛋白純化方法可以顯著提高雙向電泳圖譜的質(zhì)量，本實驗使用上述優(yōu)化所得的裂解液配方Ⅱ，對丙酮沉淀法和2D clean-up試劑盒法二種純化方式對雙向電泳圖譜的影響進行比較。從圖2-1-a中可以看出，丙酮法純化蛋白質(zhì)所得的雙向電泳圖譜在偏中性區(qū)域內(nèi)存在一定的蛋白質(zhì)丟失且橫條紋稍多，蛋白點較少。利用ImageMaster2D Platinum軟件分析圖像可獲得286個蛋白點。2D clean-up試劑盒法純化蛋白質(zhì)所得的雙向電泳圖譜上（圖2-1-b），蛋白點覆蓋范圍廣且分辨率高，在酸性端和中性端的蛋白點數(shù)量均有所增加，利用軟件分析獲得了418個蛋白點，相比于丙酮法增加了132個蛋白點，蛋白點分離明顯且恢復(fù)量較大。圖 1-1 不同裂解液配方所得 2-DE 圖譜（a）裂解液Ⅰ；（b）裂解液ⅡFig.1-1 The 2-DE map of protein samples dissolved by different lysis buffer(a) lysis bufferⅠ;(b) lysis bufferⅡ圖 2-1 不同?
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡曉輝,郭世榮,李t

本文編號：2608997