發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 14:11

【摘要】：山東省貝類資源豐富,養(yǎng)殖面積廣闊,約占海水養(yǎng)殖面積的66%,年產(chǎn)量約占全省海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%,居各類水產(chǎn)品首位。近幾年來(lái),伴隨著沿海經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,環(huán)境污染問題越來(lái)越嚴(yán)重,生態(tài)養(yǎng)殖系統(tǒng)遭到了嚴(yán)重破壞,微生物病害也日趨泛濫,某些地區(qū)養(yǎng)殖貝類出現(xiàn)了嚴(yán)重的死亡現(xiàn)象,生態(tài)養(yǎng)殖生產(chǎn)受到了嚴(yán)重的阻礙。每年夏季的7-8月份是養(yǎng)殖貝類微生物病害流行爆發(fā)的季節(jié),其中弧菌(Vibrio)是養(yǎng)殖貝類中的主要病原菌之一。因此,了解山東省主要經(jīng)濟(jì)貝類中弧菌的流行情況,并建立簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)方法顯得尤為重要。通過對(duì)山東沿海各養(yǎng)殖海區(qū)及相鄰地區(qū)的主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類養(yǎng)殖地區(qū)進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)了大量貝類死亡的現(xiàn)象。本試驗(yàn)采集了濰坊的羊口,東營(yíng)的墾利、刁口、廣利,煙臺(tái)的招遠(yuǎn)、萊州以及日照、青島、威海等地方的主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類及野生貝類。通過細(xì)菌分離、生化鑒定、16SrDNA的克隆以及序列分析。結(jié)果:共采集各地樣品的68份,其中主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類44份、野生貝類24份;從樣品中共分離細(xì)菌151株,可分為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)等,弧菌分離率高達(dá)96%;弧菌中哈氏弧菌的分離率最高為24%,其次是溶藻弧菌為21%;哈氏弧菌和副溶血性弧菌采樣分離主要在東營(yíng)、煙臺(tái)等地,溶藻弧菌主要在青島、威海等地;另外,哈氏弧菌主要分離自扇貝、花蛤、毛蚶等品種,副溶血弧菌主要分離自花蛤、毛蚶中,溶藻弧菌主要分離自魁蚶、牡蠣中,其中哈氏弧菌在各貝類中較為普遍。試驗(yàn)結(jié)果表明:哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌是山東省經(jīng)濟(jì)貝類弧菌病的主要病原菌之一,對(duì)扇貝(Scallop)、牡蠣(Ostrea gigas thunberg)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、魁蚶(Scapharca broughtonii)、花蛤(Ruditapes philippinarum)危害嚴(yán)重;弧菌病主要發(fā)生在7-8月份的高溫季節(jié),這與細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度一致。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了食品中副溶血性弧菌的檢測(cè)方法,可見國(guó)家對(duì)其重視。試驗(yàn)主要目的是建立一種貝類副溶血性弧菌的快速檢測(cè)方法,不僅保證了食品安全,也便于貝類副溶血性弧菌病的檢測(cè)。試驗(yàn)對(duì)副溶血性弧菌的不耐熱溶血毒素基因tlh設(shè)計(jì)了三對(duì)特異性引物(內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物),根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)原理進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)20株副溶血性弧菌和20株其它弧菌進(jìn)行了擴(kuò)增,結(jié)果顯示LAMP檢測(cè)方法特異性很強(qiáng),與普通PCR檢測(cè)方法對(duì)照,也顯示出很高靈敏性,達(dá)到88fg/LAMP,高出近100倍。因此,研究表明,LAMP檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng),并且耗時(shí)短(約1h)、操作簡(jiǎn)單,成為快速檢測(cè)貝類副溶血弧菌的一種有效方法。
【圖文】：

山東省貝類弧菌病流行病學(xué)調(diào)查及副溶血弧菌快速檢測(cè)方法的建立形成結(jié)構(gòu)（13），另→個(gè)重復(fù)（8）-（10）的過程，生成產(chǎn)物（14）和（15）；產(chǎn)物再以自身為模板，3，端自動(dòng)引導(dǎo)鏈置換 DNA 的合成，，生成產(chǎn)物，（16）和最初的（8），產(chǎn)物（8）開始新一輪的循環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)物（16）進(jìn)入延伸循環(huán)步驟，形成結(jié)構(gòu)（內(nèi)部引物又可以產(chǎn)物（13）和（17）作為模板，引導(dǎo)鏈置換 DNA 的合成，使產(chǎn)物列不斷延伸、環(huán)化、再延伸，最終的產(chǎn)物是一些具有不同莖長(zhǎng)度莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 DNA有許多環(huán)的結(jié)構(gòu)的 DNA 的混合物。

山東省貝類弧菌病流行病學(xué)調(diào)查及副溶血弧菌快速檢測(cè)方法的建立正向內(nèi)引物 FIP：（Forward Inner Primer）該引物是由位于 3’端的 F2 區(qū)段和位于 5端的 F1c 區(qū)段組成的，分別與靶基因的 F2c 區(qū)段以及靶基因的 F1c 序列互補(bǔ)，兩個(gè)區(qū)段之間可以直接連接也可加入酶切位點(diǎn)。反向內(nèi)引物 BIP：（Backward Inner Primer）該引物是由位于 3’端的 B2 區(qū)段和位于5’端的 B1c 區(qū)段組成的，分別與靶基因的 B2c 區(qū)段以及靶基因的 B1c 序列互補(bǔ)，兩個(gè)區(qū)段之間可以直接連接也可加入酶切位點(diǎn)。正向環(huán)引物 LF：（Forward loop Primer）該引物的位置是在 F2 區(qū)段和 F1 區(qū)段之間的區(qū)域，并且是以從 F1 到 F2 的方向來(lái)結(jié)合的。反向環(huán)引物 LB：（Backward loop Primer）該引物的位置是在 B2 區(qū)段和 B1 區(qū)段之間的區(qū)域，并且是以從 B1 到 B2 的方向來(lái)結(jié)合的。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S944

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2607646