水稻(Oryza sativa L)是世界上最主要的糧食作物之一,也是單子葉植物和谷類作物研究的模式生物。以農桿菌介導的植物遺傳轉化技術在水稻中的應用也有了長足的發(fā)展,為水稻的研究和遺傳改良提供了一個堅實的技術基礎,但是在轉化過程中,由于水稻品種或插入片段大小的不同,轉化效率也不盡相同,而部分水稻品種和大片段轉化受到了極大的影響;此外,少數(shù)bZIP轉錄因子家族B亞家族成員被報道參與了植物的生長發(fā)育和抗病抗冷等生物過程,而該亞家族其它成員則鮮有報道。在本研究中,我們新克隆了一個B-bZIP亞家族成員OsbZIP81,并對其進行了深入研究;另外對本實驗室之前研究的OsbZIP84進行了更進一步的研究。最終發(fā)現(xiàn)水稻中OsbZIP81.1可以直接作用于茉莉酸合成路徑中的基因從而調控內源茉莉酸的合成,OsbZIP81.2能夠與農桿菌毒力蛋白VirE2互作,找到并驗證了OsbZIP81和OsbZIP84的響應元件OVRE,同時探究了OsbZIP84調控水稻株高的分子機理等,具體研究結果如下:運用RT-PCR的方法獲得了OsbZIP81的三個可變剪接體,即OsbZIP81.1、OsbZIP81.2和...

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【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
縮略名詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 文獻綜述
        1.2.1 bZIP轉錄因子家族研究進展
            1.2.1.1 bZIP轉錄因子的結構特征
            1.2.1.2 擬南芥和水稻等植物中bZIP轉錄因子的分類
            1.2.1.3 水稻中bZIP轉錄因子與非生物脅迫
            1.2.1.4 水稻bZIP轉錄因子與生長發(fā)育和生物脅迫
        1.2.2 植物bZIP轉錄因子B亞家族成員研究進展
            1.2.2.1 水稻bZIP轉錄因子B(IX)亞家族成員研究進展
            1.2.2.2 擬南芥bZIP家族I亞家族成員VIP1 研究進展
            1.2.2.3 煙草bZIP家族成員RSG研究進展
        1.2.3 植物bZIP家族B亞家族成員結合的順式元件研究進展
    1.3 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 水稻材料和來源
        2.1.2 煙草材料
        2.1.3 酵母雙雜交文庫
    2.2 菌株和載體
    2.3 載體構建及遺傳轉化
        2.3.1 載體的構建
        2.3.2 農桿菌介導的水稻愈傷遺傳轉化
        2.3.3 農桿菌介導的煙草葉片遺傳轉化
    2.4 植物基因組DNA的提取和轉基因陽性材料的檢測
    2.5 總RNA的提取、反轉錄和實時定量PCR
    2.6 RNA-Seq以及分析
    2.7 植物總蛋白的提取及Western Blot
    2.8 蛋白原核表達及純化
    2.9 水稻原生質體中的亞細胞定位
    2.10 蛋白質與DNA結合分析
        2.10.1 染色質免疫共沉淀(ChIP)和ChIP-Seq數(shù)據(jù)分析
        2.10.2 隨機DNA結合篩選分析
        2.10.3 凝膠阻滯實驗(EMSA)
    2.11 蛋白相互作用分析
        2.11.1 酵母雙雜交及酵母篩庫
        2.11.2 雙分子熒光互補(BiFC)
        2.11.3 Pull down
        2.11.4 Immunoprecipitation(IP)
    2.12 水稻原生質體雙熒光素酶系統(tǒng)分析轉錄因子激活活性
3 結果與分析
    3.1 OsbZIP81 生物學功能分析
        3.1.1 OsbZIP81 生物信息學分析
        3.1.2 OsbZIP81 及其同源蛋白的進化關系分析
        3.1.3 OsbZIP81 三個轉錄本編碼蛋白轉錄激活和自激活活性分析
        3.1.4 OsbZIP81.1、OsbZIP81.2和OsbZIP81.3 的亞細胞定位分析
        3.1.5 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 的時空表達模式
        3.1.6 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 可以形成同源或異源二聚體
        3.1.7 ObZIP81.1和OsbZIP81.2 受生物和非生物脅迫的誘導
        3.1.8 在酵母中OsbZIP81.2 能夠與不同類型的毒力蛋白VirE2 互作
        3.1.9 OsbZIP81的bZIP結構域是潛在的VirE2 互作區(qū)域
        3.1.10 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 超表達轉基因水稻材料的鑒定
        3.1.11 OsbZIP81 突變體的鑒定
    3.2 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 靶基因的鑒定
        3.2.1 ChIP-Seq檢測OsbZIP81.1 全基因組范圍內結合的基因
        3.2.2 OsbZIP81.1 結合的順式作用元件的鑒定
        3.2.3 ChIP-qPCR驗證ChIP-Seq結果
        3.2.4 RNA-Seq檢測OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 調控的基因
        3.2.5 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 差異表達基因GO和KEGG富集分析
        3.2.6 OsbZIP81.1 靶基因的分析
        3.2.7 OsbZIP81.1 靶基因的GO和KEGG富集分析
        3.2.8 OsbZIP81.1 可能通過直接結合并調控茉莉酸合成路徑上的基因從而調控茉莉酸的合成
        3.2.9 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 轉基因煙草材料的構建
    3.3 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 互作蛋白的篩選
        3.3.1 OsbZIP81.2 互作蛋白的酵母文庫篩選
        3.3.2 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 互作蛋白的篩選和質譜鑒定
        3.3.3 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 與Y2H和IP-MS中部分基因的互作關系驗證
    3.4 OsbZIP84 生物學功能分析
        3.4.1 OsbZIP84 的生物信息學分析
        3.4.2 OsbZIP84 時空表達模式和亞細胞定位研究
        3.4.3 OsbZIP84 超表達和基因敲除材料的構建和鑒定
        3.4.4 OsbZIP84 超表達和RNAi轉基因植株表型分析
        3.4.5 OsbZIP84 受赤霉素和赤霉素抑制劑的抑制或誘導
        3.4.6 OsbZIP84 超表達植株和RNAi植株中GA合成路徑和信號反饋路徑部分基因表達量檢測
        3.4.7 OsbZIP84 CRISPR/Cas9 轉基因敲除植株的構建
        3.4.8 OsbZIP84 轉錄因子順式元件的鑒定
4 討論
    4.1 OsbZIP81 是一個可變剪接基因
    4.2 OsbZIP81.2 可能在農桿菌介導的水稻遺傳轉化中扮演了重要角色
    4.3 OsbZIP81 可能在水稻應對生物和非生物脅迫扮演了重要角色
    4.4 OVRE是一個新的水稻bZIP類轉錄因子順式作用元件
    4.5 OsbZIP81 可能通過茉莉酸途徑調控水稻的抗病反應
    4.6 OsbZIP84 可能通過赤霉素影響水稻的生長發(fā)育
    4.7 B-bZIP亞家族成員在功能上可能有冗余
    4.8 后續(xù)工作設想
參考文獻
附錄
    附錄Ⅰ 附圖
    附錄Ⅱ 附表
    附錄Ⅲ 部分實驗的詳細操作步驟及部分試劑配方
        Protocol 1 水稻原生質體的分離及轉化
        Protocol 2 染色質免疫共沉淀(ChIP)
        Protocol 3 隨機DNA結合篩選分析(Random DNA binding selectionassay, RDSA)
        Protocol 4 酵母雙雜交文庫篩選
        Protocol 5 農桿菌介導的水稻遺傳轉化(粳稻)
    附錄Ⅳ 作者簡介
致謝



本文編號：3882633