水稻(Oryza sativa L)是世界上最主要的糧食作物之一,也是單子葉植物和谷類作物研究的模式生物。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在水稻中的應(yīng)用也有了長足的發(fā)展,為水稻的研究和遺傳改良提供了一個堅實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ),但是在轉(zhuǎn)化過程中,由于水稻品種或插入片段大小的不同,轉(zhuǎn)化效率也不盡相同,而部分水稻品種和大片段轉(zhuǎn)化受到了極大的影響;此外,少數(shù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族B亞家族成員被報道參與了植物的生長發(fā)育和抗病抗冷等生物過程,而該亞家族其它成員則鮮有報道。在本研究中,我們新克隆了一個B-bZIP亞家族成員OsbZIP81,并對其進(jìn)行了深入研究;另外對本實(shí)驗(yàn)室之前研究的OsbZIP84進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究。最終發(fā)現(xiàn)水稻中OsbZIP81.1可以直接作用于茉莉酸合成路徑中的基因從而調(diào)控內(nèi)源茉莉酸的合成,OsbZIP81.2能夠與農(nóng)桿菌毒力蛋白VirE2互作,找到并驗(yàn)證了OsbZIP81和OsbZIP84的響應(yīng)元件OVRE,同時探究了OsbZIP84調(diào)控水稻株高的分子機(jī)理等,具體研究結(jié)果如下:運(yùn)用RT-PCR的方法獲得了OsbZIP81的三個可變剪接體,即OsbZIP81.1、OsbZIP81.2和...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略名詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 文獻(xiàn)綜述
        1.2.1 bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族研究進(jìn)展
            1.2.1.1 bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征
            1.2.1.2 擬南芥和水稻等植物中bZIP轉(zhuǎn)錄因子的分類
            1.2.1.3 水稻中bZIP轉(zhuǎn)錄因子與非生物脅迫
            1.2.1.4 水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子與生長發(fā)育和生物脅迫
        1.2.2 植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子B亞家族成員研究進(jìn)展
            1.2.2.1 水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子B(IX)亞家族成員研究進(jìn)展
            1.2.2.2 擬南芥bZIP家族I亞家族成員VIP1 研究進(jìn)展
            1.2.2.3 煙草bZIP家族成員RSG研究進(jìn)展
        1.2.3 植物bZIP家族B亞家族成員結(jié)合的順式元件研究進(jìn)展
    1.3 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 水稻材料和來源
        2.1.2 煙草材料
        2.1.3 酵母雙雜交文庫
    2.2 菌株和載體
    2.3 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3.1 載體的構(gòu)建
        2.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片遺傳轉(zhuǎn)化
    2.4 植物基因組DNA的提取和轉(zhuǎn)基因陽性材料的檢測
    2.5 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量PCR
    2.6 RNA-Seq以及分析
    2.7 植物總蛋白的提取及Western Blot
    2.8 蛋白原核表達(dá)及純化
    2.9 水稻原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位
    2.10 蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合分析
        2.10.1 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和ChIP-Seq數(shù)據(jù)分析
        2.10.2 隨機(jī)DNA結(jié)合篩選分析
        2.10.3 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)
    2.11 蛋白相互作用分析
        2.11.1 酵母雙雜交及酵母篩庫
        2.11.2 雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)
        2.11.3 Pull down
        2.11.4 Immunoprecipitation(IP)
    2.12 水稻原生質(zhì)體雙熒光素酶系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)錄因子激活活性
3 結(jié)果與分析
    3.1 OsbZIP81 生物學(xué)功能分析
        3.1.1 OsbZIP81 生物信息學(xué)分析
        3.1.2 OsbZIP81 及其同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析
        3.1.3 OsbZIP81 三個轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白轉(zhuǎn)錄激活和自激活活性分析
        3.1.4 OsbZIP81.1、OsbZIP81.2和OsbZIP81.3 的亞細(xì)胞定位分析
        3.1.5 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 的時空表達(dá)模式
        3.1.6 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 可以形成同源或異源二聚體
        3.1.7 ObZIP81.1和OsbZIP81.2 受生物和非生物脅迫的誘導(dǎo)
        3.1.8 在酵母中OsbZIP81.2 能夠與不同類型的毒力蛋白VirE2 互作
        3.1.9 OsbZIP81的bZIP結(jié)構(gòu)域是潛在的VirE2 互作區(qū)域
        3.1.10 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻材料的鑒定
        3.1.11 OsbZIP81 突變體的鑒定
    3.2 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 靶基因的鑒定
        3.2.1 ChIP-Seq檢測OsbZIP81.1 全基因組范圍內(nèi)結(jié)合的基因
        3.2.2 OsbZIP81.1 結(jié)合的順式作用元件的鑒定
        3.2.3 ChIP-qPCR驗(yàn)證ChIP-Seq結(jié)果
        3.2.4 RNA-Seq檢測OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 調(diào)控的基因
        3.2.5 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析
        3.2.6 OsbZIP81.1 靶基因的分析
        3.2.7 OsbZIP81.1 靶基因的GO和KEGG富集分析
        3.2.8 OsbZIP81.1 可能通過直接結(jié)合并調(diào)控茉莉酸合成路徑上的基因從而調(diào)控茉莉酸的合成
        3.2.9 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 轉(zhuǎn)基因煙草材料的構(gòu)建
    3.3 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 互作蛋白的篩選
        3.3.1 OsbZIP81.2 互作蛋白的酵母文庫篩選
        3.3.2 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 互作蛋白的篩選和質(zhì)譜鑒定
        3.3.3 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 與Y2H和IP-MS中部分基因的互作關(guān)系驗(yàn)證
    3.4 OsbZIP84 生物學(xué)功能分析
        3.4.1 OsbZIP84 的生物信息學(xué)分析
        3.4.2 OsbZIP84 時空表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位研究
        3.4.3 OsbZIP84 超表達(dá)和基因敲除材料的構(gòu)建和鑒定
        3.4.4 OsbZIP84 超表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型分析
        3.4.5 OsbZIP84 受赤霉素和赤霉素抑制劑的抑制或誘導(dǎo)
        3.4.6 OsbZIP84 超表達(dá)植株和RNAi植株中GA合成路徑和信號反饋路徑部分基因表達(dá)量檢測
        3.4.7 OsbZIP84 CRISPR/Cas9 轉(zhuǎn)基因敲除植株的構(gòu)建
        3.4.8 OsbZIP84 轉(zhuǎn)錄因子順式元件的鑒定
4 討論
    4.1 OsbZIP81 是一個可變剪接基因
    4.2 OsbZIP81.2 可能在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化中扮演了重要角色
    4.3 OsbZIP81 可能在水稻應(yīng)對生物和非生物脅迫扮演了重要角色
    4.4 OVRE是一個新的水稻bZIP類轉(zhuǎn)錄因子順式作用元件
    4.5 OsbZIP81 可能通過茉莉酸途徑調(diào)控水稻的抗病反應(yīng)
    4.6 OsbZIP84 可能通過赤霉素影響水稻的生長發(fā)育
    4.7 B-bZIP亞家族成員在功能上可能有冗余
    4.8 后續(xù)工作設(shè)想
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄Ⅰ 附圖
    附錄Ⅱ 附表
    附錄Ⅲ 部分實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟及部分試劑配方
        Protocol 1 水稻原生質(zhì)體的分離及轉(zhuǎn)化
        Protocol 2 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)
        Protocol 3 隨機(jī)DNA結(jié)合篩選分析(Random DNA binding selectionassay, RDSA)
        Protocol 4 酵母雙雜交文庫篩選
        Protocol 5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化(粳稻)
    附錄Ⅳ 作者簡介
致謝



本文編號：3882633