真菌是微生物源天然藥物的重要產(chǎn)生菌,許多真菌的全基因組測序表明其內(nèi)蘊(yùn)含大量次級代謝產(chǎn)物的基因簇。在通常的實(shí)驗(yàn)室條件下,許多真菌基因簇處于沉默狀態(tài),如何激活這些沉默的基因簇是藥用基因資源開發(fā)的主要研究領(lǐng)域,也是全球新藥開發(fā)的戰(zhàn)略高地。大團(tuán)囊蟲草(Tolypocladium ophioglossoides)是我國傳統(tǒng)稀貴的藥用真菌,民間用于治療血崩、月經(jīng)不調(diào)等癥。1977年,有研究者在大團(tuán)囊蟲草中發(fā)現(xiàn)化合物ophiocordin,并確定其結(jié)構(gòu)與1993年在真菌Vebticiaaium lanoiides中發(fā)現(xiàn)的balanol相同。Balanol具有很強(qiáng)的蛋白激酶PKC抑制劑活性和一定的抗真菌活性,且包含一個(gè)獨(dú)特的七元氮雜環(huán)結(jié)構(gòu),其化學(xué)全合成路徑也已被解析與實(shí)施。迄今,balanol的生物合成機(jī)制未被揭示。本課題組從西雙版納分離到一株大團(tuán)囊蟲草菌,經(jīng)過全基因組測序分析,表明其內(nèi)包含35個(gè)生物合成基因簇,其中13個(gè)為PKS類型合成基因簇、8個(gè)為NRPS類型合成基因簇、6個(gè)為PKS-NRPS混合型基因簇、4個(gè)萜類化合物基因簇和4個(gè)其他類型的基因簇,對大團(tuán)囊蟲草的發(fā)酵產(chǎn)物譜分析顯示其中大部分生物合...

【文章頁數(shù)】：140 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 大團(tuán)囊蟲草的開發(fā)研究進(jìn)展
        1.1.1 蟲草的醫(yī)藥價(jià)值
        1.1.2 蟲草的主要活性成分
        1.1.3 大團(tuán)囊蟲草的分類學(xué)地位和形態(tài)特征
        1.1.4 大團(tuán)囊蟲草的分子生物學(xué)研究進(jìn)展
    1.2 微生物隱性基因簇激活及研究進(jìn)展
        1.2.1 天然產(chǎn)物研究對新藥開發(fā)的意義
        1.2.2 常用的微生物隱性基因簇激活手段及應(yīng)用
    1.3 Balanol及相關(guān)化合物的活性研究
        1.3.1 Balanol的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 Balanol的化學(xué)全合成及其類似物的活性研究
    1.4 非核糖體肽和聚酮化合物的生物合成
        1.4.1 NRPS的組成單元和反應(yīng)過程
        1.4.2 PKS的組成單元和反應(yīng)過程
        1.4.3 對balanol生物合成的推測
第2章 大團(tuán)囊蟲草菌全基因組測序分析及遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 主要儀器設(shè)備
        2.2.2 菌種及質(zhì)粒
        2.2.3 培養(yǎng)基與溶液
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 大團(tuán)囊蟲草菌的培養(yǎng)
        2.3.2 基因組提取
        2.3.3 基因組測序及注釋
        2.3.4 基因組次級代謝產(chǎn)物合成簇分析預(yù)測
        2.3.5 大團(tuán)囊蟲草菌的抗性標(biāo)簽篩選
        2.3.6 大腸桿菌感受態(tài)制備
        2.3.7 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.8 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備
        2.3.9 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化
        2.3.10 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大團(tuán)囊蟲草菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 基因組組裝
        2.4.2 基因預(yù)測與蛋白質(zhì)功能注釋
        2.4.3 次級代謝產(chǎn)物合成簇預(yù)測
        2.4.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大團(tuán)囊蟲草菌體系的構(gòu)建
    2.5 小結(jié)與討論
第3章 Balanol隱性基因簇的激活及化合物的分離鑒定
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 主要儀器設(shè)備
        3.2.2 菌種及質(zhì)粒
        3.2.3 培養(yǎng)基與溶液
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 過表達(dá)blnR質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 blnR過表達(dá)株的構(gòu)建
        3.3.3 過表達(dá)株的發(fā)酵及發(fā)酵液HPLC分析
        3.3.4 RNA樣品提取
        3.3.5 過表達(dá)株簇內(nèi)基因RT-PCR
        3.3.6 化合物分離純化工藝
        3.3.7 質(zhì)譜和核磁分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 隱性基因簇bln的生物信息學(xué)分析
        3.4.2 blnR過表達(dá)菌株的鑒定
        3.4.3 blnR過表達(dá)菌株的形態(tài)變化
        3.4.4 blnR過表達(dá)菌株檢測產(chǎn)物譜的變化
        3.4.5 基因簇RT-PCR檢測bln基因簇各基因表達(dá)變化
        3.4.6 過表達(dá)株的發(fā)酵液的萃取及化合物分離純化
        3.4.7 化合物結(jié)構(gòu)解析
    3.5 小結(jié)與討論
第4章 Balanol生物合成途徑的解析
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 主要儀器設(shè)備
        4.2.2 菌種及質(zhì)粒
        4.2.3 培養(yǎng)基與溶液
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 qRT-PCR確定bln基因簇的邊界
        4.3.2 bln基因簇中部分基因的敲除
        4.3.3 敲除株代謝產(chǎn)物譜的LC-MS檢測
        4.3.4 釀酒酵母的LiAc轉(zhuǎn)化
        4.3.5 蛋白在釀酒酵母中的異源表達(dá)與喂養(yǎng)反應(yīng)
        4.3.6 蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化與體外反應(yīng)
        4.3.7 同位素標(biāo)記的底物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 bln基因簇邊界確定
        4.4.2 bln基因簇各基因功能注釋及分析
        4.4.3 bln基因簇中相關(guān)合成基因的敲除
        4.4.4 bln基因簇相關(guān)合成基因敲除株的產(chǎn)物譜檢測
        4.4.5 blnJ在釀酒酵母中的異源表達(dá)和喂養(yǎng)反應(yīng)
        4.4.6 blnJ在大腸桿菌中的表達(dá)及體外反應(yīng)
        4.4.7 blnF在大腸桿菌中的表達(dá)及體外反應(yīng)
        4.4.8 同位素標(biāo)記的底物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
        4.4.9 推測的balanol生物合成途徑
    4.5 小結(jié)與討論
第5章 本論文研究成果及展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士期間主要研究成果
致謝



本文編號：3866111