隨著全球氣候變暖日益加劇,高溫對作物的危害越來越受到人們的重視。近年來,水稻高熱危害已成為我國長江流域水稻生產(chǎn)亟待解決的主要問題之一。但有關(guān)水稻高溫逆境脅迫響應(yīng)的分子機制研究很少,相對水稻響應(yīng)其它逆境的研究還是一個起步階段。miRNA作為植物非生物逆境應(yīng)答過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,越來越多的證據(jù)表明miRNA對水稻的生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答起著重要的作用,miRNA研究已經(jīng)成為水稻分子遺傳調(diào)控領(lǐng)域的熱點,有關(guān)水稻抗逆的miRNA機制的認(rèn)識也不斷深入。目前,雖然已有不少水稻抗逆相關(guān)的miRNA報道,但大多數(shù)集中在低溫、干旱、高鹽、重金屬脅迫等方面,而水稻響應(yīng)高溫脅迫的miRNA至今鮮有報道。因此,我們進行水稻有關(guān)應(yīng)答高溫脅迫的miRNA研究,弄清miRNA及其靶標(biāo)基因參與調(diào)控響應(yīng)高溫逆境的途徑,在轉(zhuǎn)錄后水平上揭示出水稻響應(yīng)高溫脅迫的調(diào)控機制,為水稻耐高溫品種選育、抗逆基因發(fā)掘以及高效栽培提供新的理論支持。本論文主要研究結(jié)果如下:(1)以耐熱性水稻品種Nagina 22-19379(N22)為材料,采用高通量測序技術(shù),分析了N22高溫處理組(HT)和正常生長對照組(NT)兩個sRNA文庫,共獲得約5...

【文章頁數(shù)】：121 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮寫和符號清單
第一章 文獻綜述
    1 植物miRNA研究進展
        1.1 植物miRNA的生物合成及作用機制
        1.2 植物miRNA的功能
            1.2.1 miRNA參與植物生長發(fā)育和激素調(diào)節(jié)
            1.2.2 miRNA參與植物逆境響應(yīng)調(diào)節(jié)
        1.3 植物miRNA的常用研究方法
            1.3.1 植物miRNA的獲取途徑
            1.3.2 靶標(biāo)基因的預(yù)測和驗證
    2 水稻響應(yīng)高溫脅迫的生理機制研究
        2.1 高溫脅迫與植物光合作用
        2.2 高溫脅迫與植物膜脂氧化、膜保護酶系統(tǒng)
        2.3 高溫脅迫與植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)
    3 水稻高溫?zé)岷Φ姆肿訖C制研究
    4 水稻應(yīng)答非生物學(xué)逆境miRNA的研究
    5 本研究的目的和意義
    6 研究內(nèi)容
        6.1 水稻響應(yīng)高溫脅迫的miRNA發(fā)掘和鑒定
        6.2 水稻miRNA靶基因的降解組測序與表達模式分析
        6.3 水稻響應(yīng)高溫脅迫的miRNA的過表達分析
    7 技術(shù)路線
第二章 水稻高溫脅迫相關(guān)miRNA的分離與鑒定
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 實驗相關(guān)的數(shù)據(jù)庫及軟件
        1.5 實驗方法
            1.5.1 水稻總RNA的提取
            1.5.2 小RNA測序文庫構(gòu)建與測序
            1.5.3 小RNA測序數(shù)據(jù)分析
            1.5.4 miRNA差異表達分析
            1.5.5 實時熒光定量PCR檢測差異miRNA
    2 結(jié)果與分析
        2.1 總RNA的提取
        2.2 測序序列質(zhì)量分析
        2.3 Clean序列分析
        2.4 小RNA長度分布
        2.5 保守miRNA的鑒定
        2.6 新miRNA的鑒定
        2.7 miRNA的差異表達分析
        2.8 水稻高溫脅迫相關(guān)miRNA的熒光定量PCR分析
    3 討論
        3.1 高通量測序中樣品RNA的質(zhì)量
        3.2 高通量測序鑒定水稻高溫脅迫相關(guān)miRNA的有效性
        3.3 水稻高溫脅迫相關(guān)miRNA的表達
第三章 水稻miRNA靶基因的降解組測序與表達模式分析
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試劑
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 生物信息分析相關(guān)的數(shù)據(jù)庫及軟件
        1.5 實驗方法
            1.5.1 降解組文庫的構(gòu)建與測序
            1.5.2 降解組測序數(shù)據(jù)分析
            1.5.3 靶基因的功能注釋
            1.5.4 高溫應(yīng)答miRNA及其靶基因的表達分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 水稻降解組測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出總覽
        2.2 水稻響應(yīng)高溫脅迫miRNA靶基因的鑒定
        2.3 GO功能注釋與富集分析
        2.4 KEEG通路分析
        2.5 KOG分類注釋分析
        2.6 高溫響應(yīng)miRNA與靶基因表達模式分析
            2.6.1 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.6.2 miRNA與靶基因表達模式分析
    3 討論
        3.1 降解組測序鑒定miRNA靶基因的有效性
        3.2 水稻響應(yīng)高溫脅迫miRNA靶基因分析
        3.3 水稻響應(yīng)高溫脅迫miRNA靶基因功能分析
第四章 水稻超表達miR162a的高溫耐受性研究
    引言
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 試劑
        1.3 儀器設(shè)備
        1.4 miR162a超表達載體的構(gòu)建
            1.4.1 克隆miR162a前體的引物設(shè)計
            1.4.2 水稻基因組DNA的提取
            1.4.3 miRNA前體序列的擴增
            1.4.4 目的片段的回收
            1.4.5 目的片段與載體的雙酶切連接
            1.4.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α
            1.4.7 重組載體pCAMBIA1301-miR162a質(zhì)粒的提取
        1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及過表達植株再生
            1.5.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
            1.5.2 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化
        1.6 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定
            1.6.1 葉片Hyg和GUS基因的篩選
            1.6.2 GUS組織化學(xué)染色和活性檢測
            1.6.3 轉(zhuǎn)基因水稻中miR162a及其靶基因表達分析
        1.7 轉(zhuǎn)基因水稻對高溫脅迫的響應(yīng)
            1.7.1 對轉(zhuǎn)基因水稻T1代幼苗進行高溫脅迫處理
            1.7.2 細(xì)胞膜透性的測定
            1.7.3 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性測定
            1.7.4 Pro含量與丙二醛(MDA)含量的測定
    2 結(jié)果與分析
        2.1 miR162a過表達載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生
        2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的Hyg和GUS基因的PCR檢測
        2.4 轉(zhuǎn)基因水稻GUS組織活性化學(xué)分析
        2.5 轉(zhuǎn)基因水稻中miR162a及靶標(biāo)基因的表達檢測
        2.6 轉(zhuǎn)基因水稻T0代的表型分析
        2.7 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻T1代幼苗的生理響應(yīng)
    3 討論
第五章 全文總結(jié)
    1 水稻高溫響應(yīng)miRNA的分離與鑒定
    2 水稻高溫響應(yīng)miRNA靶基因的鑒定
    3 水稻高溫響應(yīng)miRNA靶基因的功能分析
    4 過表達miR162a對水稻高溫脅迫耐受性的影響
參考文獻
附錄A
附錄B



本文編號：3863935