植物的光合作用可以將捕獲的光能轉化為化學能,產生氧氣和能量,并且其效率與植株的生物量密切相關。光合作用中負責捕獲光能的重要分子是葉綠素,作為第一步反應,它的代謝受到嚴格的調控。葉綠素主要通過四吡咯合成途徑進行合成,鎂離子螯合酶則是此合成途徑中重要的分支酶,負責將鎂離子插入到原卟啉中,開啟鎂分支以形成最終產物葉綠素。鎂離子螯合酶是一個異源多聚體,由I、D、H三種亞基組成。本文圍繞鎂離子螯合酶,利用大豆、擬南芥和豌豆,展開其分子機理的研究。首先,我們得到大豆中鎂離子螯合酶GmChlI亞基的四個編碼基因,GmChlD的兩個編碼基因和GmChlH的三個編碼基因。盡管這些基因在大豆各個組織中表達水平各異,但是它們均在光合組織中高表達。另外各個蛋白的功能分析結果顯示,這些基因編碼的蛋白均定位在葉綠體中,并且可以互相作用,并且具有組裝成復合體的能力。體內活性分析結果顯示,GmChlH2和GmChlH3沒有完全恢復AtChlH突變體gun5-2的突變表型,而其它蛋白均可以恢復擬南芥相應突變體的黃化表型,因此我們推測這些蛋白在大豆體內均具有鎂離子螯合酶活性。其次,我們對大豆自發(fā)黃化突變體cd-5和y11...

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【學位級別】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
縮略語對照表
第一章 前言
    1.1 論文章節(jié)的劃分
    1.2 論文綜述
        1.2.1 葉綠素合成是綠色植物必需的生理活動
        1.2.2 植物體中葉綠素的合成受到嚴格的調控
        1.2.3 鎂離子螯合酶是葉綠素合成途徑中的關鍵酶
        1.2.4 鎂離子螯合酶是多源異聚體
            1.2.4.1 鎂離子螯合酶I亞基的結構
            1.2.4.2 鎂離子螯合酶D亞基的結構
            1.2.4.3 鎂離子螯合酶H亞基的結構
        1.2.5 鎂離子螯合酶的催化機制及其活性的調節(jié)
        1.2.6 鎂離子螯合酶在葉綠體與細胞核之間的信號傳導過程中的作用
    1.3 學位論文選題背景和意義
第二章 大豆編碼鎂離子螯合酶各個亞基的基因克隆與表達分析
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料
            2.2.1.1 植物材料
            2.2.1.2 培養(yǎng)條件
            2.2.1.3 菌株與質粒
            2.2.1.4 抗生素
            2.2.1.5 工具酶
            2.2.1.6 抗體
            2.2.1.7 試劑盒
            2.2.1.8 引物
        2.2.2 實驗方法
            2.2.2.1 候選基因的查找與生物信息學分析
            2.2.2.2 擬南芥植株DNA的提取及突變體的鑒定
            2.2.2.3 RNA提取和反轉錄
            2.2.2.4 基因的克隆
            2.2.2.5 實時定量PCR (qRT-PCR)
            2.2.2.6 載體的構建
            2.2.2.7 體外蛋白的提取與純化
            2.2.2.8 蛋白定量
            2.2.2.9 抗體制備及鑒定
            2.2.2.10 聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡分析
            2.2.2.11 亞細胞定位分析
            2.2.2.12 酵母雙雜交
            2.2.2.13 雙分子熒光互補實驗(BiFC)
            2.2.2.14 植物遺傳轉化
            2.2.2.15 植物葉綠素含量的測定
    2.3 實驗結果
        2.3.1 大豆中鎂離子螯合酶各個亞基的基因克隆
        2.3.2 鎂離子螯合酶各個亞基的進化樹分析
        2.3.3 GmChlI,GmChlD和GmChlH基因的表達分析
        2.3.4 GmChlI,GmChlD和GmChlH基因的啟動子分析
        2.3.5 GmChlI,GmChlD和GmChlH蛋白的亞細胞定位
        2.3.6 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測鎂離子螯合酶各個亞基之間的相互作用
        2.3.7 BiFC實驗驗證鎂離子螯合酶各個亞基之間的相互作用
        2.3.8 大豆鎂離子螯合酶基因在擬南芥突變體中的功能互補分析
    2.4 小結與討論
第三章 大豆CD-5和Y11突變體的基因克隆和機制研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料
            3.2.1.1 植物材料
            3.2.1.2 培養(yǎng)條件
            3.2.1.3 工具酶
            3.2.1.4 引物
        3.2.2 實驗方法
            3.2.2.1 基因遺傳作圖分析
            3.2.2.2 定點突變
            3.2.2.3 載體構建
            3.2.2.4 葉綠體超微結構的觀察
            3.2.2.5 植株光合參數(shù)的測定
            3.2.2.6 大豆葉綠體提取
            3.2.2.7 葉綠體蛋白的活性膠及二向銀染分析
            3.2.2.8 ATP酶活性的測定
            3.2.2.9 誘導型表達載體的轉基因植物的處理
            3.2.2.10 統(tǒng)計學分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 大豆突變體cd-5和y11的表型分析
            3.3.1.1 cd-5和y11突變體的葉綠素含量減少
            3.3.1.2 突變體的葉綠體超微結構和光合作用的分析
        3.3.2 突變基因cd-5和y11的克隆及驗證
            3.3.2.1 突變基因cd-5和y11的克隆
            3.3.2.2 在擬南芥和大豆中突變基因的驗證
        3.3.3 Q275R和R273Q對組裝和酶活性的影響
            3.3.3.1 Q275R和R273Q不影響復合體的組裝
            3.3.3.2 Q275R和R273Q在不同程度上降低GmChlI的ATP酶活性
        3.3.4 GmChlI蛋白4螺旋結構域性質的研究
            3.3.4.1 4螺旋結構域的定點突變設計
            3.3.4.2 突變蛋白的酶活性檢測
    3.4 討論
        3.4.1 cd-5和y11突變體分別是由于GmChlI1a和GmChlI1b發(fā)生Q275R點突變導致的
        3.4.2 ChlIl的ATP酶活性的喪失影響了鎂離子螯合酶的功能和各亞基在葉綠體中的穩(wěn)態(tài)含量
        3.4.3 cd-5和y11雜合子中葉綠素的減少不影響其光合效率,僅表現(xiàn)為耗散減少
        3.4.4 相比R273Q突變,Q275R對蛋白的ATP活性的干擾更嚴重
        3.4.5 AAA結構域的4對ChlI活性很重要
第四章 鎂離子螯合酶工作機制的初探
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗材料
            4.2.1.1 植物材料
            4.2.1.2 培養(yǎng)條件
            4.2.1.3 菌株與質粒
            4.2.1.4 抗生素
            4.2.1.5 工具酶
            4.2.1.6 體外表達試劑盒
            4.2.1.7 蛋白質凝膠
            4.2.1.8 引物
        4.2.2 實驗方法
            4.2.2.1 豌豆完整葉綠體的提取
            4.2.2.2 基因的體外轉錄與翻譯
            4.2.2.3 外源蛋白到葉綠體中的運送
            4.2.2.4 ^[35S]Met標記蛋白的放射自顯影
            4.2.2.5 葉綠體組分分離
    4.3 實驗結果
        4.3.1 擬南芥鎂離子螯合酶突變體的鑒定及分析
            4.3.1.1 AtChlI1突變體的鑒定及分析
            4.3.1.2 AtChlD和AtChlH突變體的鑒定及分析
        4.3.2 鎂離子螯合酶復合體的免疫印跡分析
            4.3.2.1 擬南芥中I和H亞基的二向免疫印跡分析
            4.3.2.2 大豆中鎂離子螯合酶各亞基的二向免疫印跡分析
        4.3.3 同位素標記鎂離子螯合酶蛋白運入豌豆葉綠體中的研究
            4.3.3.1 外源目的蛋白可以運入豌豆葉綠體中
            4.3.3.2 鎂離子螯合酶ChlI亞基的復合體研究
            4.3.3.3 鎂離子螯合酶ChlD亞基的復合體研究
            4.3.3.4 鎂離子螯合酶ChlH亞基的復合體研究
            4.3.3.5 鎂離子螯合酶各亞基復合體的相對位置比較
    4.4 小結和討論
        4.4.1 鎂離子螯合酶各亞基組裝機制的初探
        4.4.2 鎂離子螯合酶各亞基調節(jié)機制的推測
第五章 論文總結
參考文獻
攻讀博士期間取得的科研成果
致謝
作者簡介



本文編號：3863683