煙草(Nicotiana tabacum L.)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,但我國(guó)煙草育種面臨親本匱乏、品種遺傳背景狹窄、盲目性、重復(fù)性大等問(wèn)題。SNP標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇等方面。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)镾NP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了大量信息,但在煙草中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。因此,本研究基于煙草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的大量unigenes,利用生物信息學(xué)方法鑒定出大量SNPs,進(jìn)而根據(jù)SNP位點(diǎn)信息開(kāi)發(fā)AS-PCR和KASP標(biāo)記,并應(yīng)用于煙草種質(zhì)遺傳多樣性分析和種質(zhì)的指紋圖譜構(gòu)建。具體研究結(jié)果如下:1.采用高通量Illumina HiSeqTM對(duì)10個(gè)煙草材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得108.04G Clean bases,平均每個(gè)樣本10.084G。將reads比對(duì)到參考基因組上進(jìn)行SNP calling,共獲得SNP位點(diǎn)121416個(gè)。其中,轉(zhuǎn)換型SNP有78236個(gè),占比64.4%,顛換型SNP有42842,占比35.3%,二者之比為1.83:1。轉(zhuǎn)換型中,C->T略多,而G->T在顛換型中占多數(shù)。2.采用AS-PCR、ARMS-PCR和KASP三...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 DNA分子標(biāo)記技術(shù)的種類(lèi)及其特點(diǎn)
        1.1.1 第一代DNA分子標(biāo)記
            1.1.1.1 限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)
            1.1.1.2 隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)
            1.1.1.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)
        1.1.2 第二代DNA分子標(biāo)記
            1.1.2.1 簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記
            1.1.2.2 簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)標(biāo)記
        1.1.3 第三代DNA分子標(biāo)記
    1.2 SNP的發(fā)掘技術(shù)
        1.2.1 基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列開(kāi)發(fā)SNP
        1.2.2 基于基因組序列開(kāi)發(fā)SNP
        1.2.3 基于第二代高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)SNP
        1.2.4 基于Genotyping-by-sequencing(GBS)開(kāi)發(fā)SNP
    1.3 SNP的檢測(cè)方法及原理
        1.3.1 基于凝膠電泳的檢測(cè)方法
            1.3.1.1 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)
            1.3.1.2 酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)
            1.3.1.3 等位基因特異性PCR(AS-PCR)
        1.3.2 基于高通量、自動(dòng)化的檢測(cè)方法
            1.3.2.1 直接測(cè)序
            1.3.2.2 基因芯片
            1.3.2.3 變性高效液相色譜(DHPLC)
            1.3.2.4 質(zhì)譜檢測(cè)
            1.3.2.5 高分辨熔解曲線(xiàn)(HRM)
            1.3.2.6 KASP技術(shù)
    1.4 SNP標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用
        1.4.1 高密度遺傳圖譜的構(gòu)建
        1.4.2 重要性狀的基因定位
        1.4.3 品種鑒定及種質(zhì)資源管理
    1.5 煙草DNA分子標(biāo)記研究現(xiàn)狀
    1.6 本研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 設(shè)備與儀器
    2.2 方法
        2.2.1 煙草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
        2.2.2 SNP位點(diǎn)篩選
        2.2.3 SNP引物設(shè)計(jì)
            2.2.3.1 等位基因特異性PCR(AS-PCR)引物
            2.2.3.2 四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)引物
            2.2.3.3 競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)引物
        2.2.4 DNA提取及檢測(cè)
        2.2.5 AS-PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
        2.2.6 SNP檢測(cè)方法的選擇
        2.2.7 SNP擴(kuò)增產(chǎn)物的基因分型
        2.2.8 煙草種質(zhì)的遺傳多樣性分析
        2.2.9 DNA指紋圖譜構(gòu)建
3 結(jié)果與分析
    3.1 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的SNP分析
    3.2 DNA濃度、純度及質(zhì)量檢測(cè)
    3.3 AS-PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
        3.3.1 退火溫度的優(yōu)化
        3.3.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化
        3.3.3 反應(yīng)程序的優(yōu)化
    3.4 煙草SNP標(biāo)記檢測(cè)方法的選擇
        3.4.1 AS-PCR、Tetra-primer ARMS-PCR和 KASP對(duì)位點(diǎn)S350 的檢測(cè)效果
        3.4.2 AS-PCR、Tetra-primer ARMS-PCR和 KASP對(duì)位點(diǎn)S382 的檢測(cè)效果
    3.5 多態(tài)性SNP引物篩選
    3.6 SNP擴(kuò)增產(chǎn)物的基因分型
        3.6.1 AS-PCR檢測(cè)方法的SNP分型
        3.6.2 KASP檢測(cè)方法的SNP分型
    3.7 SNP位點(diǎn)序列的功能分析
    3.8 94份煙草材料的SNP遺傳多樣性分析
        3.8.1 SNP標(biāo)記的多態(tài)性分析
        3.8.2 94份煙草材料的聚類(lèi)分析
        3.8.3 DNA指紋圖譜的構(gòu)建
4 討論與結(jié)論
    4.1 討論
        4.1.1 PCR體系對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響
        4.1.2 引物3’端不同錯(cuò)配方式對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的影響
        4.1.3 SNP標(biāo)記檢測(cè)方法的選擇
        4.1.4 基于轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記
        4.1.5 SNP標(biāo)記的遺傳多樣性分析
        4.1.6 SNP指紋圖譜構(gòu)建
        4.1.7 SNP與生物學(xué)性狀的關(guān)系
    4.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄 Ⅰ:46對(duì)AS-PCR引物序列信息
附錄 Ⅱ:11組KASP多態(tài)性引物序列信息
附錄 Ⅲ:16組多態(tài)性SNP引物



本文編號(hào)：3824031