干旱等非生物逆境是玉米生產(chǎn)的主要限制因素。培育推廣耐旱品種是克服干旱威脅最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。但是,玉米整個(gè)物種對(duì)水分敏感,耐旱性強(qiáng)的種質(zhì)資源缺乏,常規(guī)育種對(duì)耐旱性的改良進(jìn)展不大,難以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可克隆物種間的生殖障礙,轉(zhuǎn)化利用基因其他物種的耐旱基因,為耐旱玉米品種的培育提供了新的途徑。矮沙冬青是分布于干旱沙漠地帶的超旱生植物,對(duì)干旱、鹽堿、極端溫度等非生物逆境耐受性極強(qiáng)。在前期研究中,課題組從矮沙冬青克隆了液泡膜氫離子焦磷酸酶基因AnVP1,并轉(zhuǎn)化酵母和擬南芥突變體驗(yàn)證其抗性功能。本研究用以構(gòu)建AnVP1基因單子葉植物表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織,通過篩選、分化再生植株,PCR檢測外源基因整合的陽性株系,定量PCR檢測AnVP1基因的過量表達(dá),并進(jìn)行初步的盆栽耐旱性鑒定,試圖為耐旱玉米品種培育創(chuàng)造新種質(zhì)。主要結(jié)果如下:(1)將矮沙冬青液泡膜氫離子焦磷酸酶基因AnVP1、玉米泛素啟動(dòng)子Ubiquitin和農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子T-nos,成功插入pZZ00026質(zhì)粒,構(gòu)建成AnVP1基因單子葉表達(dá)載體pZZ00026-Ubi-AnVP1-T-nos,...

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 干旱是玉米生產(chǎn)的主要限制因素
    1.2 矮沙冬青
        1.2.1 矮沙冬青的抗逆生物學(xué)特性
        1.2.2 矮沙冬青抗逆基因克隆與功能驗(yàn)證
    1.3 液泡膜氫離子焦磷酸酶
        1.3.1 液泡膜氫離子焦磷酸酶的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 液泡膜氫離子焦磷酸酶的分子結(jié)構(gòu)
        1.3.3 液泡膜氫離子焦磷酸酶的功能
        1.3.4 液泡膜氫離子焦磷酸酶基因的轉(zhuǎn)化利用
    1.4 技術(shù)路線與目的意義
2 材料和方法
    2.1 AnVP1基因單子葉植物表達(dá)載體構(gòu)建
        2.1.1 目的片段擴(kuò)增與回收
        2.1.2 酶切與連接
        2.1.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備與熱激轉(zhuǎn)化
        2.1.4 菌液PCR檢測
        2.1.5 質(zhì)粒提取與檢測
        2.1.6 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與檢測
    2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織
        2.2.1 培養(yǎng)基配方
        2.2.2 愈傷組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化
        2.2.3 愈傷組織的篩選與再生
    2.3 T₀和T₁代的檢測與篩選
        2.3.1 基因組DNA提取
        2.3.2 T₀代單株的PCR檢測
        2.3.3 T₁代田間抗性篩選和PCR檢測
    2.4 AnVP1基因的表達(dá)檢測
        2.4.1 脅迫處理和總RNA提取
        2.4.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.4.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測
    2.5 T₂代株系的表型觀察
3 結(jié)果與分析
    3.1 AnVP1基因單子葉植物表達(dá)載體
        3.1.1 AnVP1基因、Ubiquitin目啟動(dòng)子和T-nos終止子
        3.1.2 表達(dá)載體pZZ00026-Ubi-An VP1-T-nos
        3.1.3 重組農(nóng)桿菌菌株
    3.2 轉(zhuǎn)基因株系
        3.2.1 抗性愈傷組織與再生苗
        3.2.2 T₀代植株
        3.2.3 T₁代株系
    3.3 AnVP1基因的過量表達(dá)
        3.3.1 總RNA樣品質(zhì)量
        3.3.2 引物特異性
        3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.3.4 AnVP1基因的過量表達(dá)
    3.4 轉(zhuǎn)基因株系的抗性表型
4 討論
    4.1 不同轉(zhuǎn)化事件間AnVP1基因的表達(dá)差異
    4.2 矮沙冬青AnVP1基因與玉米中ZmVPP1基因的比較
5 應(yīng)用前景
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3737471