棉花（Gossypium hirsutum）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,棉纖維作為一種天然纖維,是紡織工業(yè)的主要原料。棉纖維是由棉花胚珠表皮細(xì)胞極性伸長發(fā)育而來的一種單細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表皮毛,是研究植物細(xì)胞極性伸長和細(xì)胞次生壁合成的理想的生物材料。藍(lán)銅蛋白（Blue Copper-binding Protein,BCP）是一類銅離子結(jié)合蛋白,廣泛參與植物生長發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)。在前期工作中我們從棉花中分離得到了一個纖維優(yōu)勢表達(dá)基因GhBCP4,對其在棉纖維發(fā)育中的功能進(jìn)行了研究,結(jié)果如下:1、GhBCP4蛋白亞細(xì)胞定位分析蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,GhBCP4蛋白N端有信號肽（SP）,C端有GPI錨定位點,銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于兩者之間。為研究該蛋白的細(xì)胞亞定位,我們構(gòu)建了多個GhBCP4與eGFP融合表達(dá)載體,進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化實驗。結(jié)果顯示,將eGFP報告蛋白放置于GhBCP4的C末端,在棉花陽性愈傷組織細(xì)胞中檢測不到熒光信號;去掉GhBCP4蛋白的SP和GPI位點后,剩余的中間序列與eGFP融合表達(dá),發(fā)現(xiàn)熒光信號主要集中于棉花細(xì)胞的液泡中;將eGFP序列插入到GhBCP4的銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域與GP... 

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
一、引言
    1.1 棉纖維研究進(jìn)展
        1.1.1 棉纖維概述
        1.1.2 棉纖維發(fā)育過程
        1.1.3 棉纖維發(fā)育分子機(jī)制
    1.2 植物細(xì)胞壁概述
        1.2.1 纖維素
        1.2.2 半纖維素
        1.2.3 木質(zhì)素
    1.3 藍(lán)銅蛋白研究進(jìn)展
        1.3.1 藍(lán)銅蛋白概述
        1.3.2 植物藍(lán)銅蛋白
    1.4 類受體激酶研究進(jìn)展
        1.4.1 類受體激酶概述
        1.4.2 類受體激酶CrRLKs研究進(jìn)展
    1.5 快速堿化因子研究進(jìn)展
    1.6 立題依據(jù)及研究意義
二、材料與方法
    2.1 實驗材料及器材
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌種及載體
        2.1.3 工具酶和化學(xué)試劑、試劑盒
        2.1.4 常用儲液及緩沖液
        2.1.5 常用培養(yǎng)基
        2.1.6 實驗儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 轉(zhuǎn)基因棉花材料的培養(yǎng)及材料收取
        2.2.2 棉花基因組DNA的提取及陽性苗鑒定
        2.2.3 轉(zhuǎn)基因材料轉(zhuǎn)錄組測序
        2.2.4 棉纖維材料收取及RNA提取、消化、逆轉(zhuǎn)錄
        2.2.5 實時熒光定量PCR
        2.2.6 石蠟切片的制備及染色觀察
        2.2.7 轉(zhuǎn)基因棉花纖維的細(xì)胞壁(AIR)提取及結(jié)晶纖維素含量測定
        2.2.8 載體構(gòu)建
        2.2.9 農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.10 酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109、Y187的制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.11 酵母雙雜交實驗
        2.2.12 雙分子熒光互補(bǔ)實驗
        2.2.13 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
三、實驗結(jié)果
    3.1 GhBCP4蛋白亞細(xì)胞定位分析
        3.1.1 pB1121::GhBCP4::eGFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.2 pBI121::GhBCP4::eGFP融合表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
        3.1.3 GhBCP4蛋白亞細(xì)胞定位
    3.2 T3、T4代GhBCP4轉(zhuǎn)基因棉花鑒定及棉纖維表型分析
        3.2.1 T3代GhBCP4轉(zhuǎn)基因棉花表達(dá)量檢測及棉纖維表型分析
        3.2.2 T4代GhBCP4轉(zhuǎn)基因棉花的陽性苗鑒定
        3.2.3 T4代GhBCP4轉(zhuǎn)基因棉花的棉纖維表型分析
    3.3 GhBCP4轉(zhuǎn)基因材料轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
        3.3.1 差異表達(dá)基因篩選
        3.3.2 差異基因GO富集柱狀圖
        3.3.3 GhBCP4轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比差異基因的KEGG分析
    3.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證
    3.5 GhBCP4轉(zhuǎn)基因材料纖維素含量測定
        3.5.1 GhBCP4轉(zhuǎn)基因材料石蠟切片分析
        3.5.2 GhBCP4轉(zhuǎn)基因材料細(xì)胞壁組分提取及纖維素含量測定
    3.6 GhBCP4互作蛋白的篩選
        3.6.1 蛋白互作相關(guān)載體的構(gòu)建
        3.6.2 BIFC實驗探究GhBCP4與GhCrRLK蛋白互作
        3.6.3 酵母雙雜交實驗探究GhBCP4與GhCrRLK蛋白互作
        3.6.4 Pull-Down實驗探究GhBCP4與GhCrRLK蛋白互作
四、討論
    4.1 GhBCP4促進(jìn)棉纖維細(xì)胞伸長發(fā)育及可能調(diào)控機(jī)制
    4.2 GhBCP4與GhCrRLK協(xié)同調(diào)控棉纖維發(fā)育
    4.3 RALF可能參與GhBCP4棉纖維伸長發(fā)育
參考文獻(xiàn)
縮寫表
碩士期間發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]漆酶在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 馬倩倩,趙麗紅,陳威.  工業(yè)安全與環(huán)保. 2019(08)
[2]擬南芥RALF多肽家族的功能多樣性初步分析[J]. 強(qiáng)曉楠,李鑫,陳佳,廖紅東,于峰.  生物技術(shù)通報. 2019(01)
[3]棉纖維發(fā)育的遺傳特性及相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J]. 毛瑋,曹躍芬.  浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報. 2018(06)
[4]植物受體激酶BAK1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 馮麗平,黎艷,蔣亨珂,孫歆,袁明,杜俊波.  中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2018(11)
[5]棉花功能基因組研究進(jìn)展[J]. 左東云,葉武威,程海亮,王德龍,張友平,王俊娟,王巧連,陳修貴,陸許可,宋國立.  棉花學(xué)報. 2017(S1)
[6]番茄漆酶基因LeLACmiR397的克隆與表達(dá)分析[J]. 趙先炎,龐明利,趙強(qiáng),任怡然,郝玉金,由春香.  園藝學(xué)報. 2015(07)
[7]植物RLCK的生物學(xué)功能與信號途徑研究進(jìn)展[J]. 何含杰,張黨權(quán),唐麗,楊丹.  植物生理學(xué)報. 2014(07)
[8]類受體蛋白激酶與植物非生物脅迫應(yīng)答[J]. 曹玉婷,丁艷菲,朱誠.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2014(03)
[9]BAK1調(diào)控植物免疫信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制[J]. 陳現(xiàn)朝,周永力.  植物遺傳資源學(xué)報. 2013(06)
[10]中國棉花纖維品質(zhì)檢驗和評價的研究進(jìn)展[J]. 熊宗偉,王雪姣,顧生浩,毛麗麗,張立禎,周治國.  中國棉麻流通經(jīng)濟(jì). 2013 (05)

博士論文
[1]棉花纖維伸長相關(guān)miRNA的篩選及功能驗證[D]. 劉國元.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[2]植物應(yīng)答環(huán)境信號的兩個相關(guān)基因功能研究[D]. 于峰.湖南師范大學(xué) 2013
[3]水稻類受體蛋白激酶DIS1和DIS2的功能研究[D]. 韓永峰.河北師范大學(xué) 2010

碩士論文
[1]小麥鎘積累影響秸稈細(xì)胞壁組成及乙醇產(chǎn)率的研究[D]. 程亮亮.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[2]雷蒙德氏棉HD-Zip基因家族進(jìn)化及選擇性剪切分析[D]. 薛宇.浙江農(nóng)林大學(xué) 2014



本文編號：3733177