CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為水稻育種的重要手段。為培育早熟、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源,以農(nóng)藝性狀優(yōu)良、遲熟粳稻品種香糯99-25為試驗材料,構(gòu)建了CRISPR/Cas9雙靶點表達載體對抽穗期基因DTH8進行編輯,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。用攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液侵染水稻愈傷組織,成功獲得了30株T₀轉(zhuǎn)基因苗。對T₀植株利用潮霉素特異引物進行分子檢測,其中陽性植株29株,陽性率高達96.7%。設(shè)計特異性引物對29株陽性苗的靶位點上下游600 bp進行PCR擴增測序,結(jié)果表明,7株轉(zhuǎn)基因陽性苗在第2個靶點附近發(fā)生了堿基替換或插入突變。對這7株突變株系的抽穗期進行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)DTH8-2、DTH8-5、DTH8-9、DTH8-10、DTH8-17、DTH8-21的抽穗期提前。利用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)DTH8-2、DTH8-9、DTH8-17與香糯99-25相比DTH8基因表達顯著降低。成功利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對香糯99-25的DTH8基因進行了編輯,獲得了抽穗期提前的DTH8突變體材... 

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 試驗材料
    1.2 菌株、質(zhì)粒和載體
    1.3 主要試劑
    1.4 靶點的選擇及sgRNA設(shè)計
    1.5 CRISPR-Cas9表達載體的構(gòu)建
    1.6 T0轉(zhuǎn)基因植株的獲得與檢測
    1.7 轉(zhuǎn)基因植株的突變檢測及qRT-PCR分析
    1.8 突變體表型分析
        1.8.1 抽穗期及主要農(nóng)藝性狀調(diào)查
        1.8.2 通過t檢驗驗證基因編輯的抽穗期
2 結(jié)果與分析
    2.1 構(gòu)建DTH8的CRISPR-Cas9表達載體
    2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及T0轉(zhuǎn)基因植株檢測
    2.3 靶位點測序結(jié)果及突變類型分析
    2.4 轉(zhuǎn)基因T0表型及RNA表達水平分析
    2.5 T1植株性狀分析
3 結(jié)論與討論


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]光（溫）敏雄性核不育水稻MS8S不育基因和抽穗期基因的遺傳分析與分子定位[D]. 蔡春苗.福建師范大學(xué) 2008



本文編號：3689714