水稻（Oryza.Sativa）是世界主要的糧食作物。水稻成熟種子中胚乳約占總質(zhì)量的90%。胚乳細(xì)胞的發(fā)育狀況直接決定著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。稻米胚乳堊白直接影響稻米外觀品質(zhì)、碾磨加工品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)。因此研究胚乳發(fā)育進(jìn)程及淀粉合成機(jī)理對(duì)于實(shí)現(xiàn)水稻的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)具有重要的意義。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)調(diào)控稻米脫支酶基因PUL定點(diǎn)編輯,獲得了一套有重要育種價(jià)值的pul突變體。首先設(shè)計(jì)兩個(gè)guide RNA（gRNA）靶位點(diǎn),crispr-PUL-T1和crispr-PUL-T2以定點(diǎn)編輯PUL基因的外顯子區(qū)域;然后,將這兩個(gè)靶點(diǎn)分別構(gòu)建在中間載體SK-gRNA上;最后,用一步法連接兩個(gè)中間組裝到線性化的最終載體pC1300 Cas9上。1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及T₀轉(zhuǎn)基因植株突變驗(yàn)證將構(gòu)建好的雙靶點(diǎn)pC1300 Cas9::PUL1+2載體通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中,然后轉(zhuǎn)化水稻品種ZH11的愈傷組織。CTAB法提取T₀植株的葉片的基因組DNA,并對(duì)靶序列位點(diǎn)附近片段設(shè)引物,進(jìn)行PCR酶切驗(yàn)證和Sanger測(cè)序分析。結(jié)果表明,T₀

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 胚乳發(fā)育
        1.1.1 胚乳發(fā)育與淀粉
        1.1.2 胚乳發(fā)育與蛋白
        1.1.3 胚乳細(xì)胞中的程序性死亡過(guò)程
    1.2 淀粉代謝相關(guān)基因研究進(jìn)展
        1.2.1 淀粉的合成相關(guān)基因
            1.2.1.1 淀粉的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與淀粉合成
        1.2.3 PUL研究進(jìn)展
    1.3 基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展
        1.3.1 ZFNs系統(tǒng)
        1.3.2 TALENs系統(tǒng)
        1.3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
    1.4 本實(shí)驗(yàn)研究的目的
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 質(zhì)粒載體
        2.1.3 菌株種類
        2.1.4 主要試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 PUl的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
            2.2.1.1. 靶序列選擇及引物設(shè)計(jì)
            2.2.1.2. SK-gRNA中間載體構(gòu)建
            2.2.1.3 pC1300-Cas9最終載體構(gòu)建
        2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株驗(yàn)證
        2.2.4 突變檢測(cè)
        2.2.5 農(nóng)藝性狀考察
        2.2.6 稻米生理生化品質(zhì)
        2.2.7 粒重和淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 gRNA靶位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)
    3.2 SK-gRNA和pC1300 Cas9::PUL載體的鑒定
    3.3 PUL的編輯及后代的鑒定分析
    3.4 農(nóng)藝性狀
    3.5 稻米品質(zhì)分析
    3.6 相關(guān)基因表達(dá)
第四章 結(jié)論與討論
參考文獻(xiàn)
附圖
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3651127