水稻（Oryza.Sativa）是世界主要的糧食作物。水稻成熟種子中胚乳約占總質(zhì)量的90%。胚乳細胞的發(fā)育狀況直接決定著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。稻米胚乳堊白直接影響稻米外觀品質(zhì)、碾磨加工品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)。因此研究胚乳發(fā)育進程及淀粉合成機理對于實現(xiàn)水稻的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)具有重要的意義。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對調(diào)控稻米脫支酶基因PUL定點編輯,獲得了一套有重要育種價值的pul突變體。首先設(shè)計兩個guide RNA（gRNA）靶位點,crispr-PUL-T1和crispr-PUL-T2以定點編輯PUL基因的外顯子區(qū)域;然后,將這兩個靶點分別構(gòu)建在中間載體SK-gRNA上;最后,用一步法連接兩個中間組裝到線性化的最終載體pC1300 Cas9上。1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及T₀轉(zhuǎn)基因植株突變驗證將構(gòu)建好的雙靶點pC1300 Cas9::PUL1+2載體通過熱激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中,然后轉(zhuǎn)化水稻品種ZH11的愈傷組織。CTAB法提取T₀植株的葉片的基因組DNA,并對靶序列位點附近片段設(shè)引物,進行PCR酶切驗證和Sanger測序分析。結(jié)果表明,T₀

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 胚乳發(fā)育
        1.1.1 胚乳發(fā)育與淀粉
        1.1.2 胚乳發(fā)育與蛋白
        1.1.3 胚乳細胞中的程序性死亡過程
    1.2 淀粉代謝相關(guān)基因研究進展
        1.2.1 淀粉的合成相關(guān)基因
            1.2.1.1 淀粉的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 糖轉(zhuǎn)運過程與淀粉合成
        1.2.3 PUL研究進展
    1.3 基因編輯技術(shù)研究進展
        1.3.1 ZFNs系統(tǒng)
        1.3.2 TALENs系統(tǒng)
        1.3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
    1.4 本實驗研究的目的
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料與試劑
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 質(zhì)粒載體
        2.1.3 菌株種類
        2.1.4 主要試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 PUl的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
            2.2.1.1. 靶序列選擇及引物設(shè)計
            2.2.1.2. SK-gRNA中間載體構(gòu)建
            2.2.1.3 pC1300-Cas9最終載體構(gòu)建
        2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.3 陽性轉(zhuǎn)基因植株驗證
        2.2.4 突變檢測
        2.2.5 農(nóng)藝性狀考察
        2.2.6 稻米生理生化品質(zhì)
        2.2.7 粒重和淀粉合成相關(guān)基因表達
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 gRNA靶位點選擇及引物設(shè)計
    3.2 SK-gRNA和pC1300 Cas9::PUL載體的鑒定
    3.3 PUL的編輯及后代的鑒定分析
    3.4 農(nóng)藝性狀
    3.5 稻米品質(zhì)分析
    3.6 相關(guān)基因表達
第四章 結(jié)論與討論
參考文獻
附圖
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Rice caryopsis development Ⅱ: Dynamic changes in the endosperm[J]. Xiaoba Wu,Jinxin Liu,Dongqi Li,Chun-Ming Liu.  Journal of Integrative Plant Biology. 2016(09)
[2]Quantitative Trait Loci for Grain Chalkiness and Endosperm Transparency Detected in Three Recombinant Inbred Line Populations of Indica Rice[J]. MEI De-yong,ZHU Yu-jun,YU Yong-hong,FAN Ye-yang,HUANG De-run,ZHUANG Jie-yun.  Journal of Integrative Agriculture. 2013(01)
[3]A Kelch Motif-Containing Serine/Threonine Protein Phosphatase Determines the Large Grain QTL Trait in Rice[J]. Zejun Hu,Haohua He,Shiyong Zhang,Fan Sun,Xiaoyun Xin,Wenxiang Wang,Xi Qian,Jingshui Yang,Xiaojin Luo.  Journal of Integrative Plant Biology. 2012(12)
[4]Identification of a Stable Quantitative Trait Locus for Percentage Grains with White Chalkiness in Rice （Oryza sativa）[J]. Tao Guo1, Xiaolu Liu2, Xiangyuan Wan1, Jianfeng Weng1, Shijia Liu1, Xi Liu1, Mingjiang Chen1, Jingjing Li1, Ning Su2, Fuqing Wu2, Zhijun Cheng2, Xiuping Guo2, Cailin Lei2, Jiulin Wang2, Ling Jiang1 and Jianmin Wan1,21Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Jiangsu Plant Gene Engineering Research Center, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China 2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China.  Journal of Integrative Plant Biology. 2011(08)
[5]稻米堊白形成的研究進展[J]. 彭勃,陳光輝.  作物研究. 2009(05)
[6]利用近紅外透射光譜技術(shù)同步測定糙米的多項品質(zhì)指標初報[J]. 孫成效,段彬伍,謝黎虹,陳能.  中國水稻科學(xué). 2006(04)
[7]雜交稻米質(zhì)性狀的親本配合力分子標記鑒定[J]. 劉小川,王渭霞,陳深廣,余柳青.  中國水稻科學(xué). 2005(01)
[8]水稻胚乳的發(fā)育及其養(yǎng)分輸入的途徑[J]. 王忠,李衛(wèi)芳,顧蘊潔,陳剛,石火英,高煜珠.  作物學(xué)報. 1995(05)
[9]谷類作物胚乳性狀遺傳控制的鑒別[J]. 莫惠棟.  遺傳學(xué)報. 1995(02)

博士論文
[1]水稻胚乳堊白形成機制的生理生化與轉(zhuǎn)錄組水平解析[D]. 劉曉璐.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2010



本文編號：3651127