發(fā)布時(shí)間：2022-02-21 06:47

　　肉桂醇脫氫酶（CAD）能夠?qū)⑷夤鹑┻�原生成相應(yīng)的肉桂醇,是苯丙素類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。細(xì)辛的主要功效物質(zhì)是揮發(fā)油,而揮發(fā)油主要組成成分甲基丁香酚等芳香族化合物都基于苯丙素類代謝途徑。因此,分離細(xì)辛cad基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證,是闡明細(xì)辛主要活性成分生物合成分子調(diào)控機(jī)制、開展細(xì)辛種質(zhì)遺傳改良、提升細(xì)辛藥材品質(zhì)的理論基礎(chǔ)。在基于同源克隆的原理和方法獲得cad基因序列的基礎(chǔ)上,本研究運(yùn)用在線分析工具及應(yīng)用軟件,對(duì)華細(xì)辛cad基因編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,了解其基本理化性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)信息。同時(shí)通過TOPO克隆和LR反應(yīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)菌落PCR和測序檢測成功后將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21中,用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)蛋白。然后依次對(duì)蛋白進(jìn)行可溶性分析、親和層析法純化、SDS-PAGE和Western Blot檢測,ELISA分析法定量測定。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,cad基因開放閱讀框共編碼356個(gè)氨基酸;基本理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),其編碼蛋白為酸性親水性蛋白,而且穩(wěn)定性較好;結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),其蛋白家族類型為醇脫氫酶超家族,具有鋅指結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)域包括GroES-like區(qū)域、NAD（P）結(jié)合區(qū)域和聚酮... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 細(xì)辛研究概況
        1.1.1 細(xì)辛的分類、產(chǎn)地和藥用部位
        1.1.2 細(xì)辛的藥理作用
        1.1.3 細(xì)辛揮發(fā)油的含量及提取方法
    1.2 甲基丁香酚研究進(jìn)展
        1.2.1 甲基丁香酚應(yīng)用價(jià)值
        1.2.2 甲基丁香酚的毒性
        1.2.3 甲基丁香酚含量測定方法
        1.2.4 甲基丁香酚生物合成途徑
    1.3 cad基因研究進(jìn)展
        1.3.1 cad基因的起源與分類
        1.3.2 cad基因的酶學(xué)性質(zhì)
        1.3.3 cad基因的功能與分布
        1.3.4 cad基因的表達(dá)特性
        1.3.5 cad基因的克隆
    1.4 立題背景與意義
第二章 華細(xì)辛cad基因生物信息學(xué)分析
    2.1 引言
    2.2 主要分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件
        2.2.1 網(wǎng)絡(luò)資源
        2.2.2 應(yīng)用軟件
    2.3 分析結(jié)果與討論
        2.3.1 華細(xì)辛cad基因開放閱讀框(ORF)分析
        2.3.2 華細(xì)辛cad基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析
        2.3.3 華細(xì)辛cad基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析
        2.3.4 華細(xì)辛cad基因編碼蛋白質(zhì)功能預(yù)測
        2.3.5 華細(xì)辛cad基因同源性分析
        2.3.6 華細(xì)辛cad基因分子進(jìn)化樹分析
    2.4 本章小結(jié)
第三章 華細(xì)辛cad基因的原核表達(dá)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.4 配制所需的試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 華細(xì)辛葉片總RNA的提取
        3.3.2 cDNA合成
        3.3.3 擴(kuò)增cad基因
        3.3.4 目的片段切膠回收
        3.3.5 TOPO克隆
        3.3.6 提取質(zhì)粒與序列測定
        3.3.7 LR反應(yīng)
        3.3.8 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.9 蛋白純化
        3.3.10 SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳
        3.3.11 Western blot分析
        3.3.12 ELISA分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 華細(xì)辛葉片總RNA提取
        3.4.2 cDNA合成
        3.4.3 cad基因PCR擴(kuò)增
        3.4.4 切膠回收與TOPO克隆
        3.4.5 提取質(zhì)粒
        3.4.6 LR反應(yīng)分析
        3.4.7 蛋白質(zhì)可溶性分析
        3.4.8 蛋白質(zhì)分離純化
        3.4.9 蛋白質(zhì)含量變化分析與測定
    3.5 本章小結(jié)
第四章 研究總結(jié)與展望
    4.1 研究總結(jié)
        4.1.1 生物信息學(xué)結(jié)果分析
        4.1.2 原核表達(dá)結(jié)果分析與問題討論
    4.2 工作展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
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【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]秦巴山區(qū)華細(xì)辛遺傳多樣性與揮發(fā)油成分分析[J]. 胡蘇瑩,何剛,陳蓓,崔浪軍,楊建雄.  中藥材. 2012(02)
[2]細(xì)辛藥理作用研究進(jìn)展[J]. 梁學(xué)清,李丹丹.  河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2011(04)
[3]水蒸氣蒸餾法和超聲輔助提取法提取華細(xì)辛揮發(fā)油的比較[J]. 潘紅亮,歐陽天贄.  食品科學(xué). 2011(10)
[4]中藥細(xì)辛的研究進(jìn)展[J]. 韓俊艷,孫川力,紀(jì)明山.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2011(09)
[5]細(xì)辛的鎮(zhèn)痛和抗炎作用[J]. 胡竟一,邱春燕,雷玲,李興平,白筱璐,鄧文龍.  中藥藥理與臨床. 2011(02)
[6]木質(zhì)素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的分子特征[J]. 石海燕,張玉星.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2011(05)
[7]三種細(xì)辛揮發(fā)性成分的比較研究[J]. 陳蓓,胡蘇瑩,李昆偉,崔浪軍,楊建雄.  中藥材. 2010(12)
[8]不同產(chǎn)地栽培遼細(xì)辛的揮發(fā)油研究[J]. 劉東吉,劉春生.  中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志. 2010(09)
[9]細(xì)辛替代嗎啡鎮(zhèn)痛可行性實(shí)驗(yàn)研究[J]. 楊浩,王磊,魏景莉,初雪蓮.  中國臨床研究. 2010(07)
[10]細(xì)辛屬植物資源開發(fā)應(yīng)用[J]. 董力,王海洋,馬立輝,楊珂.  黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(01)

碩士論文
[1]CEM15基因的生物信息學(xué)分析[D]. 王翊.電子科技大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3636715