香稻因其宜人的香味而受到全世界的青睞。傳統(tǒng)的育種方式在一定范圍內(nèi)能夠提高水稻產(chǎn)量和米質(zhì),但是效果不夠顯著,且工作量大,工作周期長(zhǎng)。CRISPR/Cas編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為分子育種開(kāi)辟了新的途徑。因編碼甜菜堿醛脫氫酶基因BADH2功能缺失后,可導(dǎo)致一個(gè)主要的香氣化合物2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量增多,使稻米產(chǎn)生香味。因此,本文利用CRISPR/Cas9靶向編輯技術(shù),針對(duì)BADH2第2外顯子和第7外顯子分別設(shè)計(jì)靶標(biāo)位點(diǎn)Badh2KO1和Badh2KO2,通過(guò)水稻遺傳轉(zhuǎn)化共獲得轉(zhuǎn)基因植株94株。通過(guò)對(duì)94株轉(zhuǎn)化植株的BADH2基因測(cè)序結(jié)果可知,Badh2KO1的突變植株為25株,突變率27%;Badh2KO2的突變植株為59株,突變率63%;野生型植株為10株。通過(guò)遺傳分離得到純合突變植株。Sanger測(cè)序證實(shí)這些突變植株中BADH2基因發(fā)生堿基缺失和插入,致使編碼蛋白的氨基酸序列均有不同程度的改變,且GC-MS技術(shù)檢測(cè)出這些突變植株中的2-AP含量明顯提高。這些結(jié)果表明,CRISPR/Cas9可以定向編輯水稻香味基因,使稻米具有香味。突變檢測(cè)是植物CRISPR/Cas9靶向突變研... 

【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR系統(tǒng)Ⅱ型的結(jié)構(gòu)

圖 2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯基因的示意圖Fig. 2 Schematic diagram of CRISPR/Cas9 systemSPR/Cas9 編輯技術(shù)的應(yīng)用PR/Cas9 技術(shù)作為一種基因編輯工具已經(jīng)應(yīng)用在許多的的報(bào)道不斷出現(xiàn)。Fuchs 等[25]應(yīng)用 CRISPR/Cas9 技術(shù)蛋白 eS25 基因進(jìn)行了定點(diǎn)成功敲除，構(gòu)建了核糖體蛋Zheng 等[26]設(shè)計(jì)出雙 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，在人類細(xì)胞中基因，同時(shí)證實(shí)在提供同源性修復(fù)供體時(shí)，靶位點(diǎn)基因im 等[27]將 CRISPR/Cas9 技術(shù)應(yīng)用在人類的纖維細(xì)胞和點(diǎn)突變率高達(dá) 79%。PR/Cas9 技術(shù)出現(xiàn)之后，從事農(nóng)業(yè)科研的工作人員把此中，CRISPR/Cas9 技術(shù)成功的編輯了小麥和水稻等作運(yùn)用到擬南芥基因編輯中，培育出了 ADH1 和 TT4 基種。Shan 等[30]利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)成功敲掉了小粉病的新品種。該團(tuán)隊(duì)還定點(diǎn)突變了水稻 PDS 基因。

圖 2-3 T0 代植株 DNA 序列測(cè)序結(jié)果Fig.2-3 Sequencing results of DNAsequence of T0 generation plants對(duì)兩種部分轉(zhuǎn)化植株基因測(cè)序分析得到的基因型如上圖所示：Badh2KO突變型有 1bp 的插入和 1bp 的缺失， Badh2KO2 位點(diǎn)的突變型有 1bp 1bp、2bp、5bp、18bp 的缺失，這些不同的基因突變型很可能來(lái)自不能轉(zhuǎn)化。且兩個(gè)位點(diǎn)的突變都有純合基因型和雜合基因型。Badh2KO2 位比 Badh2KO1 位點(diǎn)的多 3 種，而且突變型有很大的區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)的基因只有堿基插入和堿基的缺失兩種形式，不存在堿基的替換。就突變位置而多發(fā)生在 PAM 上游第 3 個(gè)堿基的位置。2 T1代植株突變遺傳對(duì)上述基因型突變的植株 KO1-1、KO1-3、KO1-4、KO2-1、KO2-3、KO2-5、KO2-6、KO2-7 的種子遺傳得到 T1代植株。對(duì)其 T1代植株的 DNA 測(cè)序分析我們可以看到，這 6 個(gè) T0代植株遺傳至 T1代時(shí)，幾乎將自身變型基因遺傳到了 T1代。同時(shí)有些植株在 T1代又出現(xiàn)了新的突變型

【參考文獻(xiàn)】：
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