為了研究小麥抗赤霉病相關(guān)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶TaUGT6基因的功能,利用TaUGT6基因的編碼區(qū)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-TaUGT6,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 （DE3）菌株后,經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了探索;然后利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）檢測(cè)重組蛋白,進(jìn)行蛋白純化。結(jié)果表明:Ta UGT6的編碼區(qū)為1 473 bp,導(dǎo)入大腸桿菌的TaUGT6基因能夠被誘導(dǎo)表達(dá),重組蛋白在25℃經(jīng)過夜誘導(dǎo)和37℃經(jīng)6 h誘導(dǎo)效果較好,表達(dá)重組蛋白的表現(xiàn)分子量與理論分子量基本一致,利用蛋白層析系統(tǒng)獲得了純度較高的重組可溶性蛋白。本研究為今后通過體外酶活分析、抗體制備等方法深入研究該基因的功能提供了依據(jù)。 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(11)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

TaUGT6基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

TaUGT6基因的原核表達(dá)

植物中UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucosyltransferase,UGT)是由一個(gè)基因家族所編碼，其中在小麥中發(fā)現(xiàn)了179個(gè)UGT基因，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有100多個(gè)UGTs(Yonekura-Sakakibara and Hanada,2011;He et al.,2018)。UGTs可能在植物的防御反應(yīng)中起著重要作用，將DON進(jìn)行糖基化反應(yīng)以減弱其毒性被認(rèn)為是小麥抗赤霉病重要的抗病生理過程(Buerstmayr et al.,2009)。研究表明植物UGT基因可以減弱DON毒性而提高對(duì)赤霉病的抗性，目前在小麥中僅有少數(shù)幾個(gè)UGT基因被鑒定，并且參與赤霉病抗性的作用機(jī)制仍不清楚。本研究選擇了實(shí)驗(yàn)室前期從‘蘇麥3號(hào)’中克隆的小麥UGT新基因TaUGT6，要想了解TaUGT6在小麥抗赤霉病中的具體生化功能，可以從蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行深入研究。基因的原核表達(dá)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的前提，本研究在獲得目的基因完整編碼區(qū)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了TaUGT6的原核表達(dá)載體對(duì)重組蛋白進(jìn)行成功表達(dá)與純化。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)中最常用的系統(tǒng)，影響大腸桿菌表達(dá)融合蛋白的因素包括大腸桿菌菌株、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等(倪志勇等,2010)�？紤]到IPTG濃度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)及表達(dá)的可能影響，參考前人研究(謝純政等,2009;楊書玲等,2013;許雨晨等,2016)，發(fā)現(xiàn)IPTG適宜誘導(dǎo)濃度多為0.5～1 mmol/L，故選1 mmol/L為理想濃度，然后對(duì)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)表明在恒定溫度下重組蛋白隨誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)量逐漸增加，達(dá)到峰值后蛋白表達(dá)量有降低趨勢(shì)，這可能是隨著大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌液的活力有所下降，進(jìn)而降低了融合蛋白的產(chǎn)量，最終選擇最佳表達(dá)條件為1 mmol/L IPTG在37℃振蕩培養(yǎng)6 h或者1 mmol/L IPTG在25℃振蕩培養(yǎng)過夜。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物糖基轉(zhuǎn)移酶基因的分離方法及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 羅燕,劉小剛,周志欽.  生物技術(shù)通報(bào). 2016(12)
[2]稻瘟病菌Dam1基因的克隆、原核表達(dá)及純化[J]. 許雨晨,呂哲,陳保善,彭好文.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(09)
[3]脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒性的研究進(jìn)展[J]. 許偉,耿芳芳,范夢(mèng)雪,胡文娟,宮佳杰,林根祥,李玉,吳金節(jié),王希春.  生物學(xué)雜志. 2016(01)
[4]Cloning and characterization of a novel UDP-glycosyltransferase gene induced by DON from wheat[J]. MA Xin,DU Xu-ye,LIU Guo-juan,YANG Zai-dong,HOU Wen-qian,WANG Hong-wei,FENG De-shun,LI An-fei,KONG Ling-rang.  Journal of Integrative Agriculture. 2015(05)
[5]小麥TaPDK基因的序列分析、原核表達(dá)及純化[J]. 楊書玲,張龍雨,張改生,桑青,劉紅占,朱啟迪,張新缽,趙新亮.  核農(nóng)學(xué)報(bào). 2013(08)
[6]植物UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶生化特性和功能研究進(jìn)展[J]. 姬向楠,何非,段長(zhǎng)青,王軍.  食品科學(xué). 2013(09)
[7]中國(guó)小麥赤霉病的危害及抗性遺傳改良[J]. 程順和,張勇,別同德,高德榮,張伯橋.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2012(05)
[8]棉花肉桂醇脫氫酶基因GhCAD3的克隆及原核表達(dá)[J]. 倪志勇,李波,范玲.  核農(nóng)學(xué)報(bào). 2010(05)
[9]小麥赤霉病抗性改良研究進(jìn)展[J]. 馬鴻翔,陸維忠.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2010(01)
[10]植物糖基轉(zhuǎn)移酶及其在代謝工程中的應(yīng)用[J]. 周文靈,陳剛,王瑛華,李玲.  生物技術(shù). 2009(06)

博士論文
[1]小麥抗赤霉病相關(guān)基因的克隆及功能分析[D]. 馬信.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]小麥抗赤霉病相關(guān)基因TaUGT3和TaPRP轉(zhuǎn)化普通小麥的研究[D]. 陳啟廣.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3553173