旨在探究水稻OsGRAS39（LOC_Os10g22430.1）基因的功能,采用qRT-PCR技術(shù)分析OsGRAS39在水稻不同組織中及不同非生物脅迫條件、ABA和GA₃處理下的表達情況,并基于CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)建OsGRAS39基因敲除突變體。qRT-PCR分析結(jié)果表明,OsGRAS39在所有檢測的組織中均表達,其mRNA豐度在水稻幼苗中最高,然后依次是幼根、葉片,而在抽穗期水稻的葉鞘、穗、根和莖中相對較弱;OsGRAS39的表達受高溫脅迫抑制,受低溫、NaCl和ABA誘導(dǎo);在10%PEG6000處理下,其在所有處理時間點的表達水平無顯著差異;在20μmol/L的GA₃處理下,其表達水平在2～8 h下調(diào)而在24 h上調(diào)。另外,利用無縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建了OsGRAS39基因的CRISPR/Cas9敲除載體pP1C.3-OsGRAS39-gRNA,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得30株轉(zhuǎn)基因水稻株系。靶位點測序結(jié)果表明,30株轉(zhuǎn)基因陽性水稻苗中有8株檢測到不同類型的突變,包括1個純合突變體,5個雙等位突變體和2個雜合... 

【文章來源】：華北農(nóng)學(xué)報. 2020,35(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

OsGRAS39的組織表達模式

在不同的逆境脅迫和激素的處理下,OsGRAS39的表達受到不同程度的影響。在42 ℃高溫處理下,OsGRAS39的表達在處理的最初2 h內(nèi)無顯著變化,在4 h后表達量顯著下調(diào)至初始表達量的40%以下(圖2-A)。OsGRAS39的表達受4℃低溫處理的誘導(dǎo),在1 h其表達豐度即顯著上調(diào)至初始量的2.5倍左右,在2 h其表達強度約為初始水平的5.3倍,為最高值;隨后其表達水平逐漸回落,在24 h其表達水平與初始值相當(dāng)(圖2-B)。OsGRAS39的表達受10% PEG6000處理的影響不大,其在所有處理時間點的表達水平無顯著差異(圖2-C)。在100 mmol/L NaCl處理下,OsGRAS39的表達從0.5 h開始即受到誘導(dǎo)顯著上調(diào),上調(diào)的幅度大都在2～3倍(圖2-D)。在100 μmol/L ABA處理下,OsGRAS39的表達量在1 h顯著上調(diào)至初始值的1.9倍,隨后回復(fù)至初始水平,到8,24 h再次顯著上調(diào)(圖2-E)。OsGRAS39的表達在2 h開始受到20 μmol/L GA3的抑制,其表達量在8 h下調(diào)至最低點,大約為初始值的22%,但在24 h其表達水平顯著上調(diào),約為初始值的1.9倍(圖2-F)。2.3 sgRNA靶點選擇和載體構(gòu)建

本研究采用無縫克隆的方法將sgRNA表達盒克隆到CRISPR/Cas9載體pP1c.3上。pP1c.3載體的結(jié)構(gòu)如圖3-A所示。水稻OsGRAS39基因結(jié)構(gòu)只有一個外顯子序列,為了獲得CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的定點突變導(dǎo)致的功能缺失型突變體植株,本研究利用在線設(shè)計網(wǎng)站CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)[34]分析篩選sgRNA靶位點。最終基因編輯的靶位點選擇在反義鏈靠近起始密碼子ATG的第290位堿基到271位堿基處(圖3-B),靶點序列GC含量為65%。參照CRISPR/Cas9植物基因敲除試劑盒說明書上的方法,用引物U3p.3-F/Oligo-R擴增出sgRNA克隆框,通過重組酶作用與線性化的載體pP1C.3重組構(gòu)建表達載體。重組載體經(jīng)測序確認(rèn)構(gòu)建正確,命名為pP1C.3-OsGRAS39-gRNA。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中。2.4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及突變類型分析

【參考文獻】：
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